醛酮還原酶Bbakr1參與球孢白僵菌高滲和重金屬鉻脅迫反應(yīng).pdf

1、球孢白僵菌是一種廣泛用于農(nóng)、林以及衛(wèi)生害蟲(chóng)生物防治的昆蟲(chóng)病原真菌，也是研究絲狀真菌與宿主、環(huán)境互作的模式菌株之一。醛酮還原酶是一類 NADP-依賴型氧化還原酶，廣泛存在于原核和真核生物中，參與糖代謝及多種逆境脅迫反應(yīng)，但在真菌中的功能研究鮮有報(bào)道。前期研究表明，與酵母Hog1同源的MAPK信號(hào)途徑Bbhog1是球孢白僵菌逆境適應(yīng)性和致病性的重要調(diào)控途徑。為揭示Bbhog1調(diào)控球孢白僵菌逆境脅迫反應(yīng)可能的分子學(xué)基礎(chǔ)，課題組構(gòu)建了野生型與Δ

2、Bbhog1在高滲脅迫條件下SSH文庫(kù)，獲得了15個(gè)在hog1信號(hào)阻斷突變體中表達(dá)顯著下調(diào)的基因。其中編號(hào)為H231的克隆與多種真菌的醛酮還原酶AKR編碼基因高度同源，將其命名為Bbakr1。本論文利用基因破壞、回復(fù)互補(bǔ)和超量表達(dá)的策略研究了Bbakr1與球孢白僵菌發(fā)育分化、逆境脅迫反應(yīng)和毒力的關(guān)系。主要的研究結(jié)果如下：
　　1.Bbakr1序列分析與表達(dá)特性分析
　　序列分析表明，Bbakr1含有930bp的開(kāi)放閱讀框，編

3、碼310個(gè)氨基酸的多肽，推測(cè)的分子量約34.1KDa。Bbakr1與多種真菌AKR同源蛋白高度同源。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，Bbakr1與昆蟲(chóng)病原真菌的蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)的AKR聚為一簇，推測(cè)其與蛹蟲(chóng)草AKR在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。
　　qRT-PCR分析表明，Bbakr1的表達(dá)受高滲和重金屬鉻脅迫誘導(dǎo)，且表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的變化而變化。由此推測(cè)，Bbakr1可能參與高滲脅迫反應(yīng)與重金屬鉻的解毒反應(yīng)。<

4、br>　　2.Bbakr1參與球孢白僵菌的產(chǎn)孢和發(fā)育分化
　　為明確Bbakr1與球孢白僵菌發(fā)育分化及逆境脅迫反應(yīng)和毒力的關(guān)系，本研究構(gòu)建了基因破壞(ΔBbakr1)、回復(fù)互補(bǔ)(Comp)和超量表達(dá)(OE-Bbakr1)轉(zhuǎn)化子，與親本野生菌株(WT)進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，Bbakr1介導(dǎo)菌株孢子產(chǎn)生與發(fā)育分化。
　　在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，ΔBbakr1和 OE-Bbakr1分生孢子產(chǎn)量比野生型菌株分別降低41％(P<0.01)

5、和10%(P<0.05)；在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，ΔBbakr1的分生孢子產(chǎn)量比WT降低15%(P<0.01)，而OE-Bbakr1和Comp與WT無(wú)顯著差異。由此表明，Bbakr1介導(dǎo)球孢白僵菌分生孢子的產(chǎn)生。
　　分生孢子萌發(fā)速率測(cè)定結(jié)果顯示，破壞Bbakr1導(dǎo)致菌株的萌發(fā)速率降低，ΔBbakr1萌發(fā)中時(shí)比WT滯后0.72h(P<0.05)，而OE-Bbakr1和Comp的萌發(fā)速率與WT無(wú)明顯差異。可見(jiàn)，Bbakr1介導(dǎo)球孢白僵菌分

6、生孢子的萌發(fā)。
　　Bbakr1與球孢白僵菌芽生孢子產(chǎn)生和生物量積累相關(guān)。破壞Bbakr1導(dǎo)致菌株芽生孢子產(chǎn)量顯著降低，同時(shí)降低了菌絲生物量積累，而OE-Bbakr1和Comp與WT無(wú)明顯差異。
　　3.Bbakr1與球孢白僵菌的高滲脅迫反應(yīng)有關(guān)
　　破壞Bbakr1增強(qiáng)了菌株對(duì)高滲脅迫敏感性，而OE-Bbakr1和Comp對(duì)高滲脅迫的敏感性與WT無(wú)明顯差異。真菌細(xì)胞通常積累糖醇來(lái)適應(yīng)高滲環(huán)境，胞內(nèi)糖醇積累測(cè)定結(jié)果表明

7、，破壞Bbakr1降低了胞內(nèi)赤蘚糖醇的積累，而超量表達(dá)Bbakr1則提高了胞內(nèi)赤蘚糖醇的積累。另外，破壞和超量表達(dá)Bbakr1干擾了胞內(nèi)甘油、阿拉伯糖醇和甘露糖醇積累水平。由此推測(cè)，Bbakr1可能通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)糖醇(尤其是赤蘚糖醇)的積累介導(dǎo)菌株的高滲脅迫反應(yīng)。
　　4.Bbakr1參與球孢白僵菌的重金屬鉻脅迫反應(yīng)
　　破壞Bbakr1提高了球孢白僵菌的對(duì)重金屬鉻的敏感性，而OE-Bbakr1和Comp與 WT對(duì)鉻的敏感性無(wú)

8、顯著差異。在重金屬鉻脅迫條件下，ΔBbakr1生長(zhǎng)速率比WT降低約22%(P<0.01)。重金屬對(duì)細(xì)胞的毒害主要是由于引起胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和活性醛的積累。胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平和丙二醛積累的測(cè)定結(jié)果表明，破壞Bbakr1導(dǎo)致菌株胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物降低，丙二醛含量提高。重金屬鉻脅迫4h和6h時(shí)，ΔBbakr1胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量分別比WT降低43.21%和12.74%(P<0.01)，丙二醛積累則分別是WT的6.0倍和3.4倍(P<0.01