溫度脅迫下番茄葉綠體谷胱甘肽還原酶基因.pdf

1、低溫是限制冷敏感植物產(chǎn)量和地理分布的重要因素。在正常生長條件下，植物細(xì)胞的多種代謝反應(yīng)均會(huì)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。而低溫、高溫、鹽漬、干旱、臭氧等脅迫則可導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生，若未及時(shí)清除，ROS 便會(huì)攻擊蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子引起氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞及組織死亡。植物葉綠體是ROS產(chǎn)生的主要部位之一，環(huán)境脅迫下葉綠體內(nèi)產(chǎn)生的ROS的快速清除有助于保護(hù)光合機(jī)構(gòu)，維持植物光合功能。谷胱甘

2、肽（glutathione，GSH）是葉綠體活性氧清除系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，GSH 既可以直接與ROS 反應(yīng)將其還原，又可以作為底物參與酶促反應(yīng)以清除活性氧。谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）維持著GSH 較高的還原型/氧化型的比率，這對(duì)于清除細(xì)胞內(nèi)ROS至關(guān)重要。因此，研究GR基因與植物抗逆性的關(guān)系具有重要意義。
　　 本研究從番茄葉片中克隆了葉綠體谷胱甘肽還原酶基因（LeGR），并對(duì)該基因的表達(dá)和功

3、能進(jìn)行了分析。
　　 1.利用同源序列設(shè)計(jì)兼并引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到葉綠體GR基因的中間片段，通過5'-RACE和3'-RACE分別克隆到5'片段和3'片段，拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長cDNA。命名為LeGR（EU285581）。該基因全長為2229 bp，ORF為1674 bp，編碼557個(gè)氨基酸，分子量約為59 kDa。同源序列比較表明，番茄谷胱甘肽還原酶基因的序列與煙草、擬南芥、水稻、豌豆、油菜的谷

4、胱甘肽還原酶基因的序列同源性較高。
　　 2.將p35S-LeGR-GFP 融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)。通過Confocal 觀察到GFP 激發(fā)的綠色熒光和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明LeGR基因產(chǎn)物定位于葉綠體。
　　 3.Northern 雜交分析表明，LeGR基因在葉綠素含量高的組織中表達(dá)量較高。同時(shí)該基因的表達(dá)受低溫、高溫脅迫誘導(dǎo)，其表達(dá)水平隨脅迫處理時(shí)間的延長而變化。
　　 4.LeGR基

5、因組序列全長6672bp，共有10個(gè)exon。Southern 雜交結(jié)果表明，LeGR在番茄基因組中只有一個(gè)拷貝。
　　 5.將獲得的LeGR基因與含有35S 啟動(dòng)子的pBI121 載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，用PCR及Northern 雜交的方法對(duì)帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)一步檢測，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的番茄植株。與野生型相比，轉(zhuǎn)反義LeGR基因的番茄葉片GR活性下

6、降約60％。
　　 6.構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-LeGR，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白，將誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS 獲得抗原，免疫小白鼠，其抗血清效價(jià)為1：500。Western 雜交表明，反義基因植株中LeGR基因在蛋白水平的表達(dá)明顯受到抑制。
　　 7.在低溫弱光（4℃，100μmol m-2 s-1）和高溫（40℃）脅迫條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率（Pn）和PSII 最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）下降

7、，但與野生型相比，轉(zhuǎn)反義基因株系T1-（2）T1-5和T1-9的下降更為明顯。這表明抑制LeGR的表達(dá)加劇了PSII的光抑制。在低溫弱光處理過程中，轉(zhuǎn)基因植株與野生型的氧化態(tài)P700 降低，恢復(fù)24 h后，轉(zhuǎn)反義基因三個(gè)株系分別恢復(fù)到原來的70.2％、72.9％和69.8％。經(jīng)過24 h處理，轉(zhuǎn)基因和野生型的H2O2和丙二醛含量均增加，轉(zhuǎn)反義基因植株顯著高于野生型。
　　 8.正常生長條件下，野生型與轉(zhuǎn)反義基因幼苗生長量無明顯差

8、別。但是，溫度脅迫條件下，轉(zhuǎn)反義基因幼苗生長明顯受到抑制，且葉綠素含量顯著下降。
　　 9.轉(zhuǎn)基因植株中GR活性明顯降低，抑制了谷胱甘肽循環(huán)周轉(zhuǎn)，導(dǎo)致GSH/GSSG比率降低，但谷胱甘肽總量不變；谷胱甘肽循環(huán)周轉(zhuǎn)的降低導(dǎo)致抗壞血酸周轉(zhuǎn)受到抑制，AsA/DHA比率降低，且抗壞血酸總量明顯降低。AsA-Glu循環(huán)受阻導(dǎo)致的H2O2積累是光抑制和冷敏感性增加的主要原因。另外，APX和SOD活性受到直接或間接的影響，進(jìn)一步加劇了光抑制。