番茄葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶基因（LeFAD7）的克隆及其在溫度逆境下的功能分析.pdf

1、溫度是限制植物生長、發(fā)育及產(chǎn)量的重要環(huán)境因子。當(dāng)植物遭受溫度逆境脅迫時(shí)，生物膜系統(tǒng)被認(rèn)為是最先受到傷害的部位。植物體內(nèi)膜脂不飽和脂肪酸含量越高，膜脂相變溫度就越低，低溫抗性就越強(qiáng)。反之，則相變溫度越高，高溫抗性越強(qiáng)。 ω-3脂肪酸去飽和酶是不飽和脂肪酸合成途徑中催化16∶2(7，10)或18∶2(9,12)轉(zhuǎn)化為16∶3(7，10，13)或18∶3(9,12,15)的關(guān)鍵酶。其含量的變化能改變膜脂中脂肪酸的組成，尤其是三烯脂肪酸

2、的水平，進(jìn)而影響相變溫度，改變植株對(duì)溫度脅迫的抗性。 本研究從番茄葉片中分離到番茄葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶基因。表達(dá)模式和功能分析表明，該基因的表達(dá)受低溫、水分、鹽脅迫誘導(dǎo)，受高溫脅迫抑制。抑制該基因表達(dá)可提高番茄植株的耐熱性，而過量表達(dá)該基因則增強(qiáng)番茄植株的耐冷性。主要結(jié)果如下： 1.利用同源序列設(shè)計(jì)簡并引物，先通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶基因的中間片段，然后采用RACE的方法分別

3、克隆到5'片段和3'片段，拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長cDNA。該基因全長為1683bp，ORF為1308bp，編碼435個(gè)氨基酸，分子量約為50kD。將其在GenBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為AY157317。 2.同源序列比較發(fā)現(xiàn)，番茄葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶基因的序列與馬鈴薯、甜椒、煙草、芥菜型油菜的質(zhì)體型ω-3脂肪酸去飽和酶基因同源性很高，分別為96％、92％、89％和85％。同時(shí)，進(jìn)化分析表明，該基因聚類到葉綠體型FAD7類

4、ω-3脂肪酸去飽和酶，因此將其命名為LeFAD7基因。該酶蛋白為膜蛋白，有三個(gè)跨膜信號(hào)區(qū)，N端有一段葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。結(jié)構(gòu)同源性分析表明LeFAD7有四個(gè)序列保守的結(jié)構(gòu)域，其中后三個(gè)保守區(qū)富含組氨酸，是維持其膜結(jié)合類酶特性所必須的。 3.Southern雜交結(jié)果表明，LeFAD7基因在番茄基因組中是單拷貝的，是編碼番茄ω-3脂肪酸去飽和酶多基因家族中的一員。Northern雜交結(jié)果表明LeFAD7基因在不同器官中呈非特異性表達(dá)，在葉

5、綠素含量高的組織中表達(dá)量較高，尤以幼嫩葉片中表達(dá)量最高，且受發(fā)育時(shí)期的調(diào)控。同時(shí)，該基因在所有生長溫度范圍內(nèi)(4-40℃)均有表達(dá)，受低溫、水分(20％PEG)、鹽(200mMNaCl)脅迫誘導(dǎo)，且在三種脅迫下葉片內(nèi)源表達(dá)量呈現(xiàn)先升高，然后降低，接著再升高的雙峰表達(dá)模式，高溫脅迫抑制其表達(dá)。 4.將獲得的LeFAD7基因與含有35S啟動(dòng)子的pBI121載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)入番茄中，通過

6、5‰的卡那霉素篩選，獲5得了轉(zhuǎn)基因番茄植株。用PCR及Northern雜交的方法對(duì)帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果證明部分轉(zhuǎn)基因苗中目的基因已經(jīng)整合到番茄基因組中，成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義LeFAD7基因的番茄植株。與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片類囊體膜脂及脂肪酸組分的變化主要表現(xiàn)在各類脂中18∶2和18∶3含量及PG(尤其是16∶1(3t))相對(duì)含量的變化上。LeFAD7基因表達(dá)發(fā)生沉默的轉(zhuǎn)基因番茄植株中PG的相對(duì)含量明顯

7、升高，18∶2含量明顯增加，18∶3含量相應(yīng)下降，脂肪酸飽和度升高，進(jìn)而在高溫脅迫下類囊體膜的流動(dòng)性較高；而過量表達(dá)LeFAD7基因的轉(zhuǎn)基因番茄葉片類囊體膜類脂中16∶0和PG中特有的16∶1(3t)均有所增加，18∶3含量明顯升高，而18∶2含量相應(yīng)降低，脂肪酸不飽和度升高，從而導(dǎo)致低溫脅迫下其類囊體膜的流動(dòng)性高于野生型植株。 5.LeFAD7基因發(fā)生沉默后，轉(zhuǎn)基因番茄株系在45℃以下的高溫脅迫下能維持較高的光合能力。出芽后將

8、三個(gè)番茄株系置于40℃高溫條件下生長15d，T1-8和T1-12株系的生長量均高于野生型。40℃處理24h過程中，野生型番茄葉片放氧速率下降較快，而轉(zhuǎn)基因株系下降較慢，LeFAD7基因沉默程度最高的T1-8株系下降最慢。同時(shí)，恢復(fù)過程中，野生型植株的放氧活性恢復(fù)較慢，需要48h，而轉(zhuǎn)基因植株36h時(shí)就基本恢復(fù)；處理及恢復(fù)過程中，野生型番茄的Fv/Fm下降較快，爾后的恢復(fù)較慢，而轉(zhuǎn)基因株系下降較慢，恢復(fù)速率較快。高溫脅迫下抑制LeFAD7

9、基因表達(dá)減輕了PSⅡ光抑制，同時(shí)可以提高脅迫后PSⅡ光抑制的恢復(fù)速率。抑制LeFAD7基因表達(dá)在高溫脅迫下對(duì)PSⅡ有保護(hù)作用，能提高番茄植株的高溫抗性。 高溫處理前，野生型植株及轉(zhuǎn)反義株系的葉綠體類囊體膜的超微結(jié)構(gòu)相似。高溫處理對(duì)野生型番茄葉片的超微結(jié)構(gòu)影響較大，致使葉綠體變形，體積明顯變小，葉綠體外膜被破壞，基粒片層的垛疊結(jié)構(gòu)解體，而對(duì)轉(zhuǎn)反義植株影響較小，其葉綠體基粒片層基本上未被破壞，僅有少數(shù)基粒開始出現(xiàn)膨脹以及模糊的解離狀

10、態(tài)。同時(shí)，40℃處理24h后，T1-8、T1-12株系的傷害度明顯小于野生型植株；三個(gè)株系葉片的葉綠素含量也均有下降，其中野生型下降最為明顯；野生型、T1-12和T1-8株系葉片膜脂過氧化程度增加，MDA含量分別升高至156.3％、122.6％和104.2％。高溫處理過程中，野生型株系中SOD、CAT、POD、CAT活性均低于轉(zhuǎn)反義株系；野生型植株葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的增幅較小，而轉(zhuǎn)基因株系尤其是LeFAD7基因表達(dá)受抑程度最高的T1-

11、8株系增幅較大。抑制番茄LeFAD7基因表達(dá)減輕了高溫脅迫對(duì)膜的傷害。 6.低溫弱光(4℃，100μmolm-2s-1)脅迫條件下離體處理6h后，過量表達(dá)番茄LeFAD7基因的轉(zhuǎn)基因番茄株系與野生型植株葉片放氧活性均下降，其中基因表達(dá)量最6高的轉(zhuǎn)基因株系T1-7下降幅度最??；野生型、T1-11和T1-7株系的P700的氧化狀態(tài)分別下降了44.8％、34.2％和29.3％，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系恢復(fù)速率較快，6h后T1-7株系基本完全恢

12、復(fù)，而野生型植株僅恢復(fù)到最初的86％；野生型、T1-11和T1-7株系的Fv/Fm分別下降到0.57、0.67和0.72，即在低溫弱光條件下過量表達(dá)LeFAD7基因減輕了番茄PSⅠ(光系統(tǒng)Ⅰ)和PSⅡ的光抑制。這些結(jié)果表明番茄中過量表達(dá)LeFAD7基因在低溫條件下對(duì)光系統(tǒng)有保護(hù)作用，能提高番茄植株的低溫抗性。 低溫弱光處理前三個(gè)株系葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)相似。低溫弱光處理對(duì)野生型番茄超微結(jié)構(gòu)影響較大，致使大部分葉綠體變圓，淀粉粒增

13、多，基粒片層的垛疊結(jié)構(gòu)解體，基粒溶解，基粒數(shù)目減少，而對(duì)過量表達(dá)LeFAD7基因的轉(zhuǎn)基因株系的影響較小，只有極少數(shù)葉綠體變圓，大部分基粒片層基本上保持垛疊狀態(tài)，少數(shù)出現(xiàn)模糊。與對(duì)照相比，番茄葉片低溫弱光離體處理6h后，野生型植株葉片的傷害度增加量明顯高于轉(zhuǎn)基因株系；三個(gè)株系的葉綠素含量也發(fā)生變化，其中野生型植株下降最快，基因表達(dá)量最高的T1-7株系下降最慢；野生型株系中SOD、CAT、POD、CAT活性均低于轉(zhuǎn)基因株系。低溫弱光處理6h