健康人糞便乳桿菌的分離、鑒定及遺傳多態(tài)性的初步研究.pdf

1、乳桿菌廣泛存在于人和動(dòng)物腸道、植物表面等生境中。近年來，人們從乳桿菌的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、分類學(xué)、遺傳學(xué)、微生態(tài)學(xué)、生理功能及應(yīng)用等諸多方面對(duì)其進(jìn)行廣泛而深入的研究。由于乳桿菌具有很多益生功能，國(guó)內(nèi)外已有大量含有乳桿菌的益生菌食品、保健品、藥品等產(chǎn)品問世，并受到消費(fèi)者的普遍歡迎。為了更好的促進(jìn)對(duì)乳桿菌的開發(fā)與利用，分離來源于人體腸道的乳桿菌更加具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)閬碓从谌梭w的乳桿菌更加容易在人體腸道中定植。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展及生物物

2、理技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)微生物的鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析、生理生化試驗(yàn)發(fā)展到以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)方法。這些方法鑒定微生物不需要繁瑣的微生物培養(yǎng)，通過設(shè)計(jì)的屬及種的特異性引物或探針，可以很容易的將微生物鑒定到種的水平，利用分子標(biāo)記技術(shù)甚至可以將微生物鑒定到株的水平。單純的依靠傳統(tǒng)生理生化鑒定方法對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，得出的結(jié)果不夠可信，須與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，才能對(duì)微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。本研究包括四方面內(nèi)容： 1.乳桿菌

3、的分離純化以健康成人及學(xué)齡兒童的新鮮糞便為樣品，經(jīng)過稀釋涂布于MRS培養(yǎng)基。通過形態(tài)學(xué)觀察及H2O2酶、糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)對(duì)所分得菌株進(jìn)行初步鑒定，記錄形態(tài)學(xué)特性、生理生化鑒定結(jié)果及糖發(fā)酵鑒定結(jié)果。得到乳桿菌56株。 2.16SrDNA序列同源性分析方法鑒定乳桿菌16SrDNA序列同源性分析方法的具體步驟包括：乳桿菌基因組DNA的提取，PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物測(cè)序及同源性分析。將選擇的20株試驗(yàn)菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank中該屬內(nèi)菌

4、株的16SrDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，從而準(zhǔn)確鑒定所分得菌株。最終得到嗜酸乳桿菌1株，卷曲乳桿菌1株，食竇魏斯氏菌1株，唾液乳桿菌唾液亞種1株，黏液乳桿菌2株，戊糖乳桿菌1株，發(fā)酵乳桿菌5株，植物乳桿菌8株。 3.變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)構(gòu)建乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)圖譜的構(gòu)建，選擇基因組DNA的16SrDNA的V7-V8可變區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，35～55％變形梯度凝膠電泳分離效果

5、較好，觀察指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)菌株大致分為7類。PCR-DGGE結(jié)果與鑒定結(jié)果不完全一致，說明DGGE方法也存在一定的局限性。 4.擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)技術(shù)初步研究乳桿菌的遺傳多態(tài)性從64對(duì)隨機(jī)引物中篩選出來的1對(duì)多態(tài)性較好的引物用來分析乳桿菌屬種間的遺傳多態(tài)性。反復(fù)試驗(yàn)證明AFLP指紋圖譜重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，所得的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖顯示出乳桿菌屬內(nèi)相同種不同菌株之間的遺傳多態(tài)性，說明AFLP技術(shù)可作為乳桿菌同種不同菌