AL-CS-DNA與OVA-PLGA-GC納米載體用于鼻腔粘膜免疫的研究.pdf

1、外來病源微生物（如細菌、病毒和寄生蟲等）入侵機體粘膜可造成呼吸道、消化道或全身性的疾病。粘膜免疫是在病原微生物入侵部位誘導局部長期免疫記憶的最有效方法，它是機體阻止病原微生物入侵的第一道防線。在粘膜免疫的幾種途徑中，鼻腔粘膜途徑最具非常大的潛力，它不僅可以誘導鼻腔局部免疫還能誘導遠端粘膜部位的免疫反應。納米載體是一種屬于納米級微觀范疇的亞微粒藥物載體輸送系統(tǒng)。納米載體的特點使其成為優(yōu)良的粘膜疫苗佐劑。第一，納米載體能夠控制抗原的釋放，使

2、抗原在粘膜部位停留時間大大增長；第二，納米載體能夠整合其抗原遞呈的功能和其他的效應，如免疫調節(jié)和免疫刺激作用；第三，納米載體能夠克服粘膜生理屏障，有效地增加抗原到達免疫系統(tǒng)的數(shù)量。
　　本文根據(jù)DNA疫苗和蛋白質疫苗的特點，分別設計了兩種納米載體來提高疫苗的免疫應答效果。所使用的疫苗為針對齲病致病菌（變形鏈球菌）的DNA疫苗，以及蛋白模型疫苗OVA（卵清蛋白）。首先，由于各種生理屏障的存在，防齲DNA疫苗 pGJA-P/VAX單獨

3、作為粘膜疫苗使用時，免疫保護效果有待改進。通過將陰離子脂質體（AL）引入殼聚糖（CS）納米載體，設計了一種新的DNA疫苗粘膜免疫載體AL/CS/DNA。它能夠將DNA疫苗運送至鼻腔粘膜層中，具有增強抗原在上皮細胞內吞的功能。TEM的結果顯示AL/CS/DNA是一種球形結構，它具有很高的包封率，而且能夠抵抗核酸酶的降解從而保護DNA疫苗結構和功能上的完整性。AL/CS/DNA的表面電荷具有強烈的pH環(huán)境依賴性，造成了DNA釋放由環(huán)境pH介

4、導。和傳統(tǒng)的CS/DNA復合物相比，AL/CS/DNA擁有更高的轉染效率和更長的鼻腔停留時間。這些特性使得AL/CS/DNA能夠顯著誘導更高水平的IgA（p<0.01）以及長效粘膜免疫力，提示AL/CS/DNA是一種非常有潛力的DNA疫苗粘膜給藥載體。
　　其次，聚乳酸羥基乙酸（PLGA）納米囊是一種有潛力的蛋白質疫苗載體，用于粘膜免疫時能夠顯著增強免疫應答，同時具有良好的生物降解性和生物相容性。然而PLGA納米囊惰性的、負電荷表

5、面限制了其與負電荷細胞膜之間的相互作用，一定程度上限制了細胞對它的攝取。本研究采用乙二醇殼聚糖（GC）對PLGA納米囊表面進行修飾，來增強其粘膜免疫應答的效果。GC的作用主要體現(xiàn)在幾個方面：一是增強樹突狀細胞（DC細胞）對納米囊的內吞；二是可以與溶酶體相互作用來促進納米囊從溶酶體中逃逸；三是延長抗原在鼻腔粘膜的停留時間。這些優(yōu)勢使得OVA/PLGA/GC（OPG）納米囊能夠誘導有效的粘膜免疫應答、系統(tǒng)性免疫應答和細胞免疫應答。本研究完成

6、的主要工作有：
　　(1)利用自組裝的方法制備了AL/CS/DNA復合物。通過體外細胞轉染實驗證實N/P比為7、lipid/DNA比為3時可以得到較高的轉染效率。所得的AL/CS/DNA復合物納米粒為球形，結構規(guī)整。
　　(2)凝膠阻滯法和圓二色譜法證實了AL/CS/DNA復合物能夠有效地壓縮DNA，但不影響DNA的B型構象。同時AL/CS/DNA復合物對環(huán)境pH變化敏感，DNA的釋放具有pH依賴性。
　　(3)體內熒

7、光成像法證實了AL/CS/DNA比CS/DNA具有更長的鼻腔停留時間、更好的穿透粘膜層的能力。AL加入并不影響CS/DNA復合物對粘液素蛋白吸附能力和打開細胞連接的能力，而是通過增強上皮細胞對AL/CS/DNA的攝取來延長復合物的鼻腔停留時間。
　　(4)與CS/DNA相比，AL/CS/DNA通過鼻腔粘膜途徑能夠顯著誘導唾液IgA應答，且持續(xù)時間維持12周以上。AL/CS/DNA能夠同時在近端粘膜和遠端粘膜系統(tǒng)產生粘膜應答，有潛力

8、作為誘導全身性粘膜免疫應答的載體。
　　(5)利用復乳溶劑揮發(fā)法制備了OP（OVA/PLGA）和 OPG（OVA/PLGA/GC）納米囊。制得的OP和OPG納米囊均為球形結構且形態(tài)規(guī)整，OPG有明顯的核殼型結構。
　　(6)細胞攝取和共定位成像實驗證實了GC對PLGA納米囊的表面修飾可以進一步提高DC細胞對PLGA納米囊的攝取，而對PLGA納米粒在細胞內的分布沒有影響。OP和OPG納米囊兩者都沒有進入到細胞核中，且兩者都具有

9、從溶酶體中逃逸的能力。
　　(7)體內實時熒光成像法證實了GC對PLGA納米囊的表面修飾可以大大延長抗原在鼻腔中的停留時間，一方面是由于細胞對兩者攝取的效率不同，更多的OPG進入到了細胞中；二是OP和OPG納米囊的粘附性不同，OPG納米囊在鼻腔粘膜擁有更廣的分布。但是兩者都具有粘膜穿透能力，都進入到了粘膜層中，而OVA只是停留于粘膜層外。
　　(8)本研究對OP和OPG納米囊在誘導粘膜免疫、系統(tǒng)性免疫和細胞免疫的能力進行了評