白芍對小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛效果及固有免疫分子機制研究.pdf

1、炎癥(Inflammation)為機體受到有害刺激時所產(chǎn)生的一種抗損傷的防御性病理反應(yīng)，其臨床特征為局部的紅(Redness)、腫(Swelling)、熱(Heat)、痛(Pain)和機體功能障礙(Loss of function)，其發(fā)熱、紅腫、疼痛等臨床癥候與中醫(yī)的“熱”證型所伴有的高熱、汗出、舌紅苔黃、肌膚生瘡發(fā)熱等癥候相似。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“熱”和“火”是炎癥的主要病因病機，機體感受熱邪、或外感寒邪化熱、或內(nèi)有郁積化熱而致“熱”證

2、，臨床多見高熱、煩渴、汗出等癥。根據(jù)“熱”的證型以及不同發(fā)展階段，中醫(yī)對“熱”證的治則有清熱瀉火、滋陰清熱、清泄里熱、清上溫下等。
　　白芍是常用中藥，有白芍、赤芍之分，二者各具不同的功效?！夺t(yī)學(xué)啟源》中記載白芍功能主治包括“安脾經(jīng)、治腹痛、瀉肝”，古方中也不乏有以白芍為君藥的方劑，如白芍散，黃蓮白芍湯等。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中關(guān)于白芍的抗炎免疫活性及作用機制的研究報道甚少，而炎癥和免疫在組織、細(xì)胞、分子水平上是緊密聯(lián)系不可分割的過程，

3、因此，本研究擬采用急性炎癥模型和疼痛反應(yīng)模型，觀察白芍(以下簡稱Pae)的抗炎鎮(zhèn)痛活性，并從病理組織學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等角度初步探討其部分固有免疫分子機制，以期明確白芍抗炎免疫藥理活性的作用機理，為中藥白芍的進一步研發(fā)和有效運用提供理論依據(jù)。其試驗主要結(jié)果及結(jié)論如下:
　　1.白芍的抗炎鎮(zhèn)痛活性研究
　　試驗采用二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致毛細(xì)血管通透性改變試驗和醋酸致小鼠扭體反應(yīng)試驗研究白芍的抗炎鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果表明:白芍

4、的三個劑量(10g/kg、5g/kg和2.5g/kg)均能不同程度抑制小鼠耳腫脹，其高劑量(10g/kg)、中劑量(5g/kg)組的小鼠耳腫脹率分別為22.39％(P＜0.05)、28.90％(P＜0.01)，顯著或極顯著降低二甲苯致小鼠的耳腫脹。白芍高、中、低劑量的腹腔毛細(xì)血管通透性增加抑制率分別為25.12％、41.87％、4.43％，其白芍的中劑量(5g/kg)組的腹腔毛細(xì)血管通透性增加抑制率顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。白

5、芍的三個劑量均能降低醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，以中劑量(5g/kg)的效果最佳，扭體反應(yīng)次數(shù)抑制率為43.88％，與陰性對照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果提示:白芍可減輕炎癥、舒緩疼痛，具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛活性。
　　2.小鼠膿毒癥模型的建立及白芍對小鼠膿毒癥的干預(yù)效果
　　通過腹腔注射LPS建立小鼠膿毒癥模型，進行白芍干預(yù)小鼠膿毒癥的試驗研究。觀察LPS膿毒癥模型復(fù)制后2h～72h小鼠的臨床癥候，表現(xiàn)為:LPS攻毒后小鼠出現(xiàn)

6、食欲下降，行動緩慢、倦怠、嗜睡、被毛蓬松等癥狀，剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)皮下、腸系膜充血或出血，部分肝組織可見白色點狀壞死;組織學(xué)觀察可見LPS模型組在攻毒后前期和后期小鼠肝細(xì)胞界限不清或消失，肝竇淤血，炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞變性，部分呈彌漫性壞死;染毒后12h～36h病理變化最明顯，表現(xiàn)為中央靜脈擴張充血，靜脈壁細(xì)胞脫落，甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡壞死。經(jīng)白芍干預(yù)治療后，小鼠的臨床癥狀及剖檢癥狀較LPS模型組有所減輕，肝組織結(jié)構(gòu)有不同程度的損傷，肝小葉結(jié)構(gòu)較

7、清晰，見少量出血，肝細(xì)胞排列較紊亂，部分出現(xiàn)變性壞死，可見未完全溶解的核碎屑;48h少數(shù)肝細(xì)胞炎性浸潤伴有輕度水腫，胞漿疏松化，中央靜脈少許擴張，周圍有少量的肝細(xì)胞壞死及炎性浸潤;72h肝組織結(jié)構(gòu)清晰，有少量的炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞較完整;白芍干預(yù)治療組小鼠死亡數(shù)較LPS膿毒癥組少，且其組織病理變化與地塞米松干預(yù)組小鼠相近。表明白芍可減輕LPS膿毒癥小鼠的臨床癥候、病理損傷及減少小鼠死亡數(shù)，對小鼠膿毒癥具有保護作用。
　　3.白芍對

8、LPS膿毒癥小鼠肝組織中TLR4及下游相關(guān)信號分子mRNA表達(dá)量的影響
　　分子同有免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TLR4能夠識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，激活MyD88、NF-κB等基因的轉(zhuǎn)錄，進而發(fā)揮固有免疫作用，因此，分析信號通路中重要因子表達(dá)量的變化可以初步判定藥物的作用靶位。本試驗分析TLR4/MyD88/NF-κB信號通路中幾個重要節(jié)點分子表達(dá)量的變化，初步確定白芍發(fā)揮抗炎作用的固有免疫機制及其可能作用靶標(biāo)。

9、試驗采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LPS模型組小鼠的TLR4、MyD88、NF-κB等目的基因mRNA表達(dá)水平在12h～36h均不同程度升高，其相對表達(dá)量分別12h、36h、24h達(dá)到峰值，顯著或極顯著高于陰性對照組(P＜0.05或P＜0.01)。而經(jīng)白芍干預(yù)處理的小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB總體

10、水平均低于未給予藥物干預(yù)的LPS模型組，分別在12h(7.15±0.23 vs9.44±1.12)、36h(4.44±0.98 vs13.06±1.7)、24h(3.29±0.43 vs7.34±2.06)極顯著低于LPS模型組;TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平亦顯著降低(2.37±0.61 vs7.34±2.06)、(14.92±2.07 vs15.52±1.12); IL-4的表達(dá)水平均高于LPS模型組小鼠，分別在6h、24

11、h～72h與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)水平均略低于LPS模型組小鼠，36h其表達(dá)水平與模型組比較差異極顯著(P＜0.01)，但其余時間點與LPS模型組的差異均不顯著。研究結(jié)果表明:TLR4可識別LPS，并激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，提高促炎因子相關(guān)基因TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)的表達(dá)水平，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生;白芍可通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，抑制LPS受體TLR

12、4及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MyD88、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、促炎細(xì)胞因子TNF-a、IL-1β及促進抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10的mRNA水平的表達(dá)，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)效果。提示TLR4/MyD88/NF-κB信號通路中MyD88、NF-κB等各節(jié)點重要分子可能是白芍發(fā)揮抗炎作用的靶標(biāo)。
　　4.白芍對LPS膿毒癥小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1含量的影響
　　TNF-α、IL-1β是機體重要的致炎因

13、子，其合成和分泌能夠激活炎癥反應(yīng)。IL-4、IL-10是重要的抗炎因子及免疫抑制劑，二者可強烈抑制免疫細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等炎癥介質(zhì)，抑制單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。同時，HMGB1作為一種晚期炎癥介質(zhì)，是膿毒癥的重要調(diào)節(jié)因子。中藥機制之一為影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成和釋放米發(fā)揮其抗炎作用?；诖?，本試驗通過建立小鼠LPS膿毒癥模型，以及用白芍干預(yù)后2h～72h小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-4、

14、IL-10及HMGB1含量的檢測，評價白芍對小鼠LPS膿毒癥的抗炎效果。試驗采用雙抗體夾心ELISA方法，建立小鼠血清中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于計算待檢樣品的含量。小鼠經(jīng)LPS處理后，各時間點血清中致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、HMGB1含量均高于陰性對照組，分別在6h、12h、36h達(dá)到最大值。而經(jīng)過白芍處理后，TNF-α

15、、IL-1β、HMGB1含量峰值的分別為達(dá)到328.63±16.49pg/ml、176.38±11.70pg/ml和97.73±11.85ng/ml，較LPS模型組有顯著下降(P＜0.01或P＜0.05);IL-4水平在36h(128.76±24.68ng/ml)、48h(95.71±57.09pg/ml)顯著高于膿毒癥模型組(P＜0.05)，而IL-10的含量顯著高于同時間點陰性對照組，在36h～48h顯著低于LPS模型組，但與LPS