Frizzled1及相關(guān)蛋白在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)與調(diào)控.pdf

1、前言：
　　成釉細(xì)胞瘤(ameloblastomas，ABs)是發(fā)生于頜骨內(nèi)的腫瘤，大多數(shù)來(lái)源于牙齒正常發(fā)育完成后殘余的牙源性上皮剩余，少部分來(lái)自口腔黏膜上皮基底細(xì)胞、含牙囊腫、始基囊腫和角化囊腫襯里上皮的演變。在我國(guó)，其發(fā)生率約占牙源性腫瘤的63.2％。雖屬良性腫瘤，但其生長(zhǎng)具有局部侵襲性，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，少數(shù)病例發(fā)生惡變后可導(dǎo)致區(qū)域性淋巴結(jié)、肺等遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，甚至有發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的報(bào)道，因此在治療上通常采取廣泛的外科手術(shù)切除。

2、r>　　Wnt信號(hào)通路是一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)通路，它控制胚胎發(fā)育和組織同源性的遺傳程序控制。Wnt/β-catenin信號(hào)分子在發(fā)育和維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，許多遺傳性疾病、癌癥、慢性炎癥及其他疾病與Wnt信號(hào)通路中多種信號(hào)分子的異常相關(guān)。ABs是與牙齒發(fā)育有關(guān)的牙源性腫瘤，Wnt信號(hào)通路又是牙齒發(fā)育過(guò)程中所必不可少的信號(hào)調(diào)節(jié)通路。同時(shí)本課題組檢測(cè)了ABs中Wnt信號(hào)通路的下游因子表達(dá)情況:原位雜交方法結(jié)果顯示c-myc、cyclin

3、 D1 mRNA在ABs中表達(dá)增強(qiáng)，特別是復(fù)發(fā)和惡變病例;β-catenin、Axin2等在ABs中均有較高的陽(yáng)性表達(dá)率及少數(shù)病例存在突變。推測(cè)此通路可能與ABs的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
　　Wnt蛋白結(jié)合到富含半胱氨酸的frizzled蛋白的結(jié)構(gòu)域上，啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路。 Fzd1是7次跨膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞表面受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族新成員，是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，與Wnt3a和Wnt7b配體結(jié)合激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路

4、的異常激活使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的β-catenin異常積聚，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，引起腫瘤的發(fā)生。
　　最近報(bào)道Wnt/frizzled信號(hào)通路同樣參與炎癥進(jìn)程的調(diào)節(jié)。Fzd1受體是一個(gè)炎癥反應(yīng)巨噬細(xì)胞活性相關(guān)的新型標(biāo)志物。Fzd1的表達(dá)依賴于TNF和NF-κB:Fzd1可以獨(dú)立于誘導(dǎo)TLR信號(hào)通路，TNF可以獨(dú)立誘導(dǎo)Fzd1 mRNA的表達(dá)。在炎性條件下，TNF在微生物中介導(dǎo)了Fzd1的表達(dá)，F(xiàn)zd受體表達(dá)將上調(diào)。在巨噬細(xì)胞反應(yīng)中Fzd1參

5、與調(diào)控Wnt3a的信號(hào)通路。Wnt3a在經(jīng)微生物刺激后通過(guò)降低TNF，影響巨噬細(xì)胞效應(yīng)器功能。通過(guò)Wnt3a降低人單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞層的遷移，從而降低炎癥反應(yīng)，降低腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Wnt信號(hào)通路和TLR/NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路之間相互影響，在進(jìn)化過(guò)程中他們之間具有高度的保守信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。NF-κB是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。NF-κB在抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管發(fā)生及促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移方面也發(fā)揮著作用。
　　慢性

6、炎癥與一些惡性腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)病過(guò)程中起重要的作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵主導(dǎo)因素，可直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)?；罨蟮腡AM通過(guò)分泌TNF-α等多種細(xì)胞因子促進(jìn)了腫瘤生成、侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移;該過(guò)程也是免疫調(diào)控中的重要環(huán)節(jié)。
　　研究Fzd1等Wnt信號(hào)分子在成釉細(xì)胞瘤腫瘤上皮及腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)，為近一步探討Wnt信號(hào)通路在成釉細(xì)胞瘤發(fā)生中的作用與機(jī)制打下一定基礎(chǔ)。
　　材料與方法：

7、　　46例（附表）ABs樣本均來(lái)自2007年至2012年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院外科和病理科，新鮮手術(shù)標(biāo)本-80℃凍存。診斷標(biāo)準(zhǔn)依WH02005分類標(biāo)準(zhǔn)。以正常黏膜10例，KCOT14例，OSCC26例做對(duì)照，用RT-PCR方法檢測(cè)ABs中NF-κB mRNA表達(dá)情況;用Real-time PCR方法，以管家基因18srRNA校正，檢測(cè)ABs中Fzd1、Wnt3a、CD68及TNF-α mRNA表達(dá)情況;用Western-blot方法，以

8、GAPDH做內(nèi)參，檢測(cè)Fzd1、Wnt3a及TNF-α蛋白表達(dá);以β-actin做內(nèi)參，檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá);用免疫組化SP法觀察Fzd1、TNF-α、CD68及NF-κB在ABs瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，以了解Fzd1、Wnt3a、CD68、NF-κB及TNF-α在ABs表達(dá)情況。探討影響Fzd1、Wnt3a、CD68、NF-κB及TNF-α基因在ABs中的表達(dá)機(jī)制，進(jìn)而為ABs診斷和治療提供新的理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　

9、一、ABs中Fzd1、Wnt3a、CD68、TNF-α及NF-κB基因mRNA表達(dá)結(jié)果
　　用RT-PCR方法檢測(cè)了46例ABs中NF-κB mRNA表達(dá)情況，用Real-timePCR方法，以18srRNA做內(nèi)參，檢測(cè)了46例ABs中Fzd1、Wnt3a、CD68、NF-κB及TNF-α mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示:Fzd1在上皮的巨噬細(xì)胞中有表達(dá)，在腫瘤間質(zhì)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞中也有Fzd1的表達(dá)，ABs中Fzd1組的基因表達(dá)水平比

10、正常黏膜高0.139倍;Wnt3a基因表達(dá)水平比正常黏膜高1.44倍;CD68基因表達(dá)水平比正常黏膜高0.43倍;TNF-α基因表達(dá)水平比正常黏膜高0.47倍;NF-κB基因表達(dá)水平比正常黏膜高。
　　二、ABs中Fzd1、Wnt3a、TNF-α及NF-κB蛋白表達(dá)結(jié)果
　　用Western-blot方法，以GAPDH做內(nèi)參，檢測(cè)了46例ABs中Fzd1、Wnt3a、TNF-α蛋白表達(dá)情況;以β-actin做內(nèi)參，檢測(cè)NF-

11、κB蛋白表達(dá);結(jié)果顯示，F(xiàn)zd1、Wnt3a、TNF-α、NF-κB在ABs中的表達(dá)明顯高于正常黏膜中的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在ABs的各組織類型之間，F(xiàn)zd1、Wnt3a、TNF-α及NF-κB蛋白表達(dá)無(wú)明顯意義(P＞0.05)。
　　三、ABs中Fzd1、CD68、NF-κB及TNF-α免疫組化結(jié)果
　?。ㄒ唬〧zd1、NF-κB及TNF-α的表達(dá):Fzd1、NF-κB及TNF-α蛋白在ABs和正常黏膜中

12、的表達(dá)有顯著差別(P＜0.001)，F(xiàn)zd1、NF-κB及TNF-α在ABs中的表達(dá)明顯高于在正常黏膜中的表達(dá)。Fzd1、NF-κB及TNF-α蛋白在ABs和OSCC中的表達(dá)情況有顯著差別(P＜0.001)，F(xiàn)zd1、NF-κB及TNF-α在OSCC中的表達(dá)明顯高于在ABs中的表達(dá)。Fzd1、NF-κB及TNF-α蛋白在ABs和KCOT中的表達(dá)情況差別無(wú)明顯差異(P＞0.05)，F(xiàn)zd1、NF-κB及TNF-α在KCOT和ABs中的表達(dá)

13、無(wú)明顯差異。
　?。ǘ〤D68的表達(dá):CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞在ABs中表達(dá)，F(xiàn)zd1在ABs的腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞亦可見(jiàn)陽(yáng)性染色的表達(dá)，其它漿細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等偶有陽(yáng)性表達(dá)。
　?。ㄈ㏕AMs的表達(dá):人成釉細(xì)胞瘤組中間質(zhì)浸潤(rùn)TAMs數(shù)量為22.7±2.5，正?？谇火つそM中間質(zhì)浸潤(rùn)TAMs數(shù)量為5.8±1.8，人成釉細(xì)胞瘤組較正?？谇火つそMTAMs數(shù)量較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　（四）TNF-α、NF

14、-κB、TAMs表達(dá)之間的關(guān)系:人成釉細(xì)胞瘤組中TNF-α蛋白與TAMs的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.01)，NF-κB的表達(dá)與TAMs的浸潤(rùn)數(shù)量呈正相關(guān)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　frizzled1、Wnt3a參與成釉細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，不僅可以通過(guò)介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路影響成釉細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展，也可以影響炎癥過(guò)程，通過(guò)腫瘤炎性微環(huán)境參與成釉細(xì)胞瘤的疾病過(guò)程;CD68可以作為組織中巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，檢測(cè)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在人