小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血性腦卒中恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、腦卒中(stroke)，又稱(chēng)腦血管意外，是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，其臨床表現(xiàn)主要以猝然昏厥、口眼歪斜、半身不遂、舌強(qiáng)言蹇和智力障礙為特征。流行病學(xué)研究顯示，缺血性腦卒中的發(fā)病率占所有腦卒中的60～80％，并且以每年8.7％的速率增長(zhǎng)，而出血性腦卒中的發(fā)病率以每年1.7％的速率降低。隨著我國(guó)老齡化人口的增多，缺血性腦卒中發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。然而，由于缺血性腦卒中發(fā)病的病理進(jìn)程復(fù)雜，迄今為止，正式被批準(zhǔn)使用的安全有效的治療

2、藥物還為數(shù)不多。許多研究證實(shí)，線粒體通過(guò)多種機(jī)制在缺血性腦卒中病理生理進(jìn)程中扮演著重要的角色，是缺血性損傷的重要亞細(xì)胞靶標(biāo)。中藥復(fù)方小續(xù)命湯是中醫(yī)從外風(fēng)論治療缺血性腦卒中的經(jīng)典有效方劑。小續(xù)命湯有效成分組包含中藥復(fù)方小續(xù)命湯中所有與其治療腦缺血損傷密切相關(guān)的藥理活性組分。因此，采用大腦中動(dòng)脈暫時(shí)閉塞所致腦缺血再灌注大鼠為觀察對(duì)象，從整體水平上考察中藥復(fù)方小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用，探討線粒體在缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中的作用

3、。
　　第一部分 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期的總體保護(hù)作用研究
　　目的:考察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期的總體保護(hù)作用。
　　方法:選用健康雄性SD大鼠，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實(shí)現(xiàn)再灌注。應(yīng)用Zea-Longa's級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)價(jià)動(dòng)物腦缺血程度，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥銀杏葉提

4、取物EGb761組，以假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組，術(shù)后1～14天灌胃給藥，每日一次。通過(guò)Zea-Longa's級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分、改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)和轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)(CT)等系列行為學(xué)評(píng)價(jià)手段來(lái)評(píng)測(cè)小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠不同恢復(fù)時(shí)期行為學(xué)的變化，每天一次，連續(xù)測(cè)定14天。選用TTC染色法觀察大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹。
　　結(jié)果:與模型組相比，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，小續(xù)命湯有效成分組能夠降低MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)

5、分，表現(xiàn)為大鼠前后肢屈曲程度降低，行走趨于正常，在平衡木上停留時(shí)間增長(zhǎng)，感覺(jué)功能恢復(fù)靈敏，轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)中MCAO大鼠向右轉(zhuǎn)向的比率接近正常;其中自MCAO術(shù)后5天起，小續(xù)命湯有效成分組能明顯改善MCAO大鼠上述神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，與模型組相比差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)。同時(shí)小續(xù)命湯有效成分組能夠明顯減少術(shù)后5天和14天缺血再灌注大鼠腦組織梗死體積百分比(P＜0.01），縮小術(shù)后5天缺血再灌注大鼠的半球腫脹(P＜0.01）。

6、r>　　結(jié)論:小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠損傷恢復(fù)早期即產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期腦組織氧化還原水平失衡的影響
　　目的:考察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期腦組織氧化還原水平失衡的影響。
　　方法:選用健康雄性SD大鼠，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實(shí)現(xiàn)再灌注。應(yīng)用Zea-Longa's級(jí)

7、標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)價(jià)動(dòng)物腦缺血程度，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥銀杏葉提取物EGb761組，以假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組，術(shù)后1～5天灌胃給藥，每日一次。提取分離給藥5天后MCAO大鼠缺血半暗帶和核心區(qū)腦組織，通過(guò)測(cè)定腦組織內(nèi)蛋白質(zhì)羰基含量、丙二醛(MDA)含量以及一氧化氮合酶(NOS)活性，來(lái)評(píng)估小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷的改善作用。通過(guò)測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶

8、(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等內(nèi)源性抗氧化酶的活力和還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)等內(nèi)源性抗氧化劑的含量變化，來(lái)研究小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥5天后，能夠顯著降低MCAO大鼠腦組織中一氧化氮合酶(NOS)活性(P＜0.05)，明顯降低丙二醛(MDA)和蛋白羰基含量(P＜0.05

9、，P＜0.01)，緩解缺血再灌注后大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷;與此同時(shí)，小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著提高大鼠腦組織過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)以及谷胱甘肽還原酶(GR)的活性(P＜0.05，P＜0.01)，但對(duì)還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量影響不明顯。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯有效成分組能夠調(diào)節(jié)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期腦組織氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，從而對(duì)大鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞的起到保護(hù)作

10、用。
　　第三部分 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期腦線粒體功能損傷的影響
　　目的:考察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期腦線粒體功能損傷的影響。
　　方法:選用健康雄性SD大鼠，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實(shí)現(xiàn)再灌注。應(yīng)用Zea-Longa's級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)價(jià)動(dòng)物腦缺血程度，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和

11、陽(yáng)性藥銀杏葉提取物EGb761組，以假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組，術(shù)后1～5天灌胃給藥，每日一次。提取分離給藥5天后MCAO大鼠缺血側(cè)大腦（除缺血核心區(qū)外），通過(guò)測(cè)定線粒體的氧化磷酸化功能、線粒體呼吸酶活性(琥珀酸脫氫酶SDH、細(xì)胞色素C氧化酶COX)、線粒體ROS含量、膜電位、線粒體PT孔的開(kāi)放程度和ATP含量，研究小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血再灌注大鼠線粒體功能的影響。同時(shí)，提取分離給藥5天后MCAO大鼠缺血半暗帶和核心區(qū)腦組織，Western

12、 Blot法檢測(cè)線粒體啟動(dòng)的凋亡通路相關(guān)蛋白，包括Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax等，研究小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥5天后，能夠顯著改善缺血再灌注大鼠腦線粒體的呼吸活力(P＜0.05，P＜0.01)，顯著提高線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性(P＜0.05），降低線粒體ROS的含量(P＜0.05，P＜0.01)，

13、明顯提高腦線粒體膜電位(P＜0.05）和促進(jìn)腦組織ATP的合成(P＜0.05），但對(duì)腦線粒體膜腫脹度和細(xì)胞色素C氧化酶(COX)的影響不明顯。與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥5天后，能夠顯著下調(diào)促凋亡蛋白Bax，上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2(P＜0.05，P＜0.01);與此同時(shí)，小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著上調(diào)Caspase-3和Caspase-9，下調(diào)Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9(P＜0.0