HSPA12A在缺血性腦卒中保護(hù)作用研究.pdf

1、背景和目的:
　　腦缺血損傷，又稱腦梗塞、腦卒中，是世界上死亡率第一、致殘率第三的重大疾病。尋求新的保護(hù)腦缺血的基因并充分利用其改善腦缺血損傷功能，一直是我們亟待解決的重要任務(wù)。熱休克蛋白是機(jī)體在受到不良環(huán)境因素刺激后大量產(chǎn)生并發(fā)揮重要作用的一組應(yīng)激蛋白質(zhì)。A12A(HSPA12A)是一種新發(fā)現(xiàn)的熱休克蛋白，屬于HSP70家族中的一員。研究表明，HSPA12A轉(zhuǎn)錄本在哺乳動物腦組織中含量非常豐富，但其在腦組織中的作用卻沒有過相關(guān)研

2、究。因此我們課題組通過構(gòu)建hspa12a基因條件性敲除(Conditional knockout，cKO)小鼠以及制備腦缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，VR)模型，研究HSPA12A是否參與腦I/R后的修復(fù)以及其在腦I/R后修復(fù)中所起的作用，以期為腦卒中的診斷和治療提供一定的理論參考依據(jù)。
　　方法:
　　采用hspa12a基因條件性敲除的小鼠為實驗對象，通過構(gòu)建腦I/R損傷模型，觀察、比較小鼠I/R

3、損傷后HSPA12A表達(dá)量的變化以及hspa12a基因缺失對小鼠腦I瓜損傷的影響，從而探索HSPA12A在腦組織中的病理生理作用。
　　1.HSPA12A蛋白的定位:采用免疫熒光法(Immunofluorescence，IF)，將HSPA12A分別與神經(jīng)元標(biāo)記蛋白NeuN、β-TublinⅢ共染。
　　2.HSPA12A在腦I/R后的水平變化:(1)動物水平上，采用拴線穿過小鼠左頸內(nèi)動脈堵住大腦中動脈，缺血1h，再灌注不同時

4、間來誘導(dǎo)I/R模型。(2)在細(xì)胞水平上，通過將原代神經(jīng)元細(xì)胞換入無糖培養(yǎng)基并放入乏氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，重新恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h來誘導(dǎo)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucosedeprivation/reoxygenation，OGD/R)模型。收集細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot, WB)以及實時定量PCR(Real time polymerase chain reaction，RT-PCR)，分別檢測HSPA1

5、2A的蛋白與mRNA表達(dá)量的變化情況。
　　3.實驗動物模型的構(gòu)建:本課題組與南京大學(xué)模式動物研究合作，采用Cre-loxp系統(tǒng)，構(gòu)建hspa12a條件性基因敲除小鼠，后者與Cre轉(zhuǎn)基因鼠交配，得到hspa12a基因敲除鼠。
　　4.hspa12基因敲除鑒定:(1)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)確定小鼠的基因型;(2)用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測小鼠腦組織中HSPA12A蛋白表達(dá)水平

6、;(3)用實時定量PCR測小鼠腦組織中HSPA12A mRNA的表達(dá)量;(4)免疫熒光染色檢測HSPA12A蛋白熒光。
　　5.腦I/R損傷程度的評定:(1)梗死面積:經(jīng)過缺血1h/再灌24 h后，取腦組織，均勻切成5片，用2％的氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride，TTC)染色，拍攝圖片后統(tǒng)計梗死面積。(2)神經(jīng)行為學(xué)評分:經(jīng)過缺血1h/再灌24 h后，通過觀察小鼠精神狀態(tài)、運(yùn)動強(qiáng)度、觸須

7、反應(yīng)、平衡度、對稱性五項指標(biāo)綜合評分。(3)海馬神經(jīng)元損傷:缺血1h/再灌24h后，取腦組織經(jīng)固定、包埋后制成石蠟切片，經(jīng)過蘇木精—伊紅(Hemotoxylin&Eosin Staining，HE)染色和尼氏(Nissl)染色后，觀察比較海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。(4)神經(jīng)元凋亡:缺血1h/再灌24 h后，取腦組織制備石蠟切片后，采用TUNEL法染色，拍攝圖片后統(tǒng)計凋亡細(xì)胞百分比。以及缺血1h/再灌3h后，免疫印跡法測定腦組織中促凋亡蛋白B

8、ax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析:使用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)之間用均數(shù)檢驗(t檢驗），多組數(shù)據(jù)之間用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05表示有顯著性差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.HSPA12A蛋白在小鼠腦組織中表達(dá)最高，且表達(dá)在神經(jīng)元中。
　　2.HSPA12A在I/R的腦組織、氧糖剝奪/復(fù)氧后的神經(jīng)元中表達(dá)下降。