鈣敏感受體在小鼠缺血性腦卒中的作用及機制.pdf

1、第一部分:線栓法制備不同體重昆明種小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的建立及評價
　　目的:
　　缺血性腦卒中的預防及有效治療是臨床上面臨的在國際醫(yī)學上的一項重要課題。制備一種理想的大腦中動脈栓塞(modified neuro-ogiealseverityseores,MCAO)動物模型是研究該類疾病的重要手段。本文利用線栓法復制小鼠腦缺血/再灌注(MCAO)損傷模型,探討與小鼠MCAO模型穩(wěn)定性相關的潛在因素,為建立成模率高、死

2、亡率低的小鼠MCAO模型提供實驗依據。
　　方法:
　　昆明種(KM)小鼠100只,體重20-39g,雌雄均入選,分別將小鼠按照體重以及性別分為假手術組(n=20)和不同體重實驗組(n=80)。模型組依照體重大小分組:A組(♂,20-24g)、B組(♂,25-29g)、C組(♂,30-34g)、D組(♂,35-39g),E組(♀,20-24g)、F組(♀,25-29g)、G組(♀,30-34g)、H組(♀,35-39g)。線

3、栓法制備局灶性腦缺血/再灌注模型,缺血再灌注24h后評估模型,對實驗小鼠進行神經功能損傷評分以及腦梗死體積的測定。
　　結果:
　　1.成功率死亡率的檢測:實驗結果顯示,雄性(♂)KM小鼠的手術耐受能力高于雌性(♀)昆明種小鼠。其中,A組、B組的成功率高達70％、80%,且B組的死亡率較低。
　　2.神經功能評分的測定:同假手術組相比,各實驗組小鼠腦缺血再灌注后,出現(xiàn)神經異常,與雌性(♀)KM小鼠相比,雄性(♂)KM小

4、鼠的行為學評分較高。A、B兩組小鼠的神經行為學評分均比C、D組高(P<0.01);E、F組小鼠的行為學評分同G、H組相比較有顯著性增加(P<0.01)。另外,A組的行為學評分高于E組(P<0.01);B組的行為學評分與F組相比明顯提高(P<0.01)。
　　3.梗死面積的測定:模型組小鼠腦切片有明顯的白色梗死區(qū)。A、B兩組小鼠的梗死灶面積較C、D組有顯著性提高(P<0.01);E、F兩組小鼠腦梗死灶的面積顯著高于G、H組(P<0.

5、05)。另外,B組的腦梗塞面積與F組相比明顯提高(P<0.01)。
　　結論
　　線栓法是一種簡單、穩(wěn)定、可靠的制備小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的方法。影響線栓法構建模型成功率的因素有許多,其中小鼠體重與線栓直徑比例的匹配、品系性別的選擇、手術時間、進線深度以及25-28℃左右的室溫是手術過程中需注意的重要因素。本實驗發(fā)現(xiàn),體重在25g左右的雄性KM小鼠制備MCAO模型成功率較高,適合建立小鼠局灶性腦缺血/再灌注(MCAO)

6、模型。
　　第二部分:鈣敏感受體在小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制
　　目的:
　　臨床上缺血性腦卒中的死亡率很高,其發(fā)病機制極其復雜,目前尚未明了,因此需要進一步闡明缺血性腦卒中的發(fā)病機制,尋找新的有效靶點。本文探討了鈣敏感受體(CaSR)的活化對于腦缺血再灌注損傷中神經元細胞的凋亡及其相關的細胞信號傳導途徑的影響。
　　方法:
　　線栓法構建小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷動物模型,觀察CaSR在腦缺血再灌

7、注損傷中的作用及其機制。本實驗使用CaSR激動劑三氯化釓(Gdcl3)以及CaSR抑制劑NPS2390進行了干預研究。23-25g的雄性KM小鼠隨機分為假手術組(Sham)、模型組(I/R)、激動劑組(I/R+Gdcl3)、阻斷劑組(I/R+NPS2390),每組16只。腦缺血2h再灌注22h后,對小鼠進行神經行為學評估,TTC染色檢測腦梗死體積,HE染色觀察腦組織病理形態(tài)學變化,Western Blot檢測腦組織CaSR、Bax、Bc

8、l-2、p-JNK/JNK和p-P38/P38表達的影響。
　　結果:
　　1.神經功能評分及腦梗死體積的測定:與假手術組相比,模型組小鼠神經功能評分較高,TTC染色顯示小鼠腦組織切片呈明顯的蒼白色梗死灶。與模型組相比,激動劑組小鼠的神經功能評分進一步增加,其腦梗死灶面積顯著增大;而CaSR抑制劑組可降低小鼠神經功能評分,減少腦梗死面積。
　　2.CaSR表達水平:模型組小鼠腦皮層與海馬CaSR蛋白表達水平顯著高于假手

9、術組。與模型組相比,激動劑組小鼠腦皮層與海馬CaSR蛋白表達顯著上調,而抑制劑組可顯著抑制CaSR蛋白表達上調。
　　3.HE染色病理結果:假手術組小鼠腦組織結構完整,模型組小鼠神經細胞排列紊亂,體積縮小,胞體皺縮,部分細胞壞死,而激動劑組小鼠腦組織神經細胞損傷更加顯著;抑制劑組小鼠腦組織神經細胞損傷有所減輕。海馬區(qū)神經元的損傷較皮層區(qū)嚴重。
　　4.腦組織Bcl-2及Bax蛋白的表達:
　　與假手術組相比,模型組小鼠

10、腦組織皮層和海馬區(qū)Bax表達增加,Bcl-2表達減少;與模型組比較,激動劑GdCl3可進一步上調腦組織Bax蛋白表達,抑制Bcl-2蛋白表達;而抑制劑NPS2390可抑制腦組織Bax的表達,上調Bcl-2蛋白表達。
　　5.腦組織中p-JNK/JNK、p-P38/P38蛋白的表達:假手術組小鼠腦皮層海馬區(qū)有少量磷酸化JNK及磷酸化P38的表達;模型組小鼠腦組織p-JNK、p-P38的表達水平上調,CaSR激動劑Gdcl3可顯著上調