鈣敏感受體在小鼠缺血性腦卒中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分:線栓法制備不同體重昆明種小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的建立及評(píng)價(jià)
　　目的:
　　缺血性腦卒中的預(yù)防及有效治療是臨床上面臨的在國(guó)際醫(yī)學(xué)上的一項(xiàng)重要課題。制備一種理想的大腦中動(dòng)脈栓塞(modified neuro-ogiealseverityseores,MCAO)動(dòng)物模型是研究該類疾病的重要手段。本文利用線栓法復(fù)制小鼠腦缺血/再灌注(MCAO)損傷模型,探討與小鼠MCAO模型穩(wěn)定性相關(guān)的潛在因素,為建立成模率高、死

2、亡率低的小鼠MCAO模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　昆明種(KM)小鼠100只,體重20-39g,雌雄均入選,分別將小鼠按照體重以及性別分為假手術(shù)組(n=20)和不同體重實(shí)驗(yàn)組(n=80)。模型組依照體重大小分組:A組(♂,20-24g)、B組(♂,25-29g)、C組(♂,30-34g)、D組(♂,35-39g),E組(♀,20-24g)、F組(♀,25-29g)、G組(♀,30-34g)、H組(♀,35-39g)。線

3、栓法制備局灶性腦缺血/再灌注模型,缺血再灌注24h后評(píng)估模型,對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分以及腦梗死體積的測(cè)定。
　　結(jié)果:
　　1.成功率死亡率的檢測(cè):實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,雄性(♂)KM小鼠的手術(shù)耐受能力高于雌性(♀)昆明種小鼠。其中,A組、B組的成功率高達(dá)70％、80%,且B組的死亡率較低。
　　2.神經(jīng)功能評(píng)分的測(cè)定:同假手術(shù)組相比,各實(shí)驗(yàn)組小鼠腦缺血再灌注后,出現(xiàn)神經(jīng)異常,與雌性(♀)KM小鼠相比,雄性(♂)KM小

4、鼠的行為學(xué)評(píng)分較高。A、B兩組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均比C、D組高(P<0.01);E、F組小鼠的行為學(xué)評(píng)分同G、H組相比較有顯著性增加(P<0.01)。另外,A組的行為學(xué)評(píng)分高于E組(P<0.01);B組的行為學(xué)評(píng)分與F組相比明顯提高(P<0.01)。
　　3.梗死面積的測(cè)定:模型組小鼠腦切片有明顯的白色梗死區(qū)。A、B兩組小鼠的梗死灶面積較C、D組有顯著性提高(P<0.01);E、F兩組小鼠腦梗死灶的面積顯著高于G、H組(P<0.

5、05)。另外,B組的腦梗塞面積與F組相比明顯提高(P<0.01)。
　　結(jié)論
　　線栓法是一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠的制備小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的方法。影響線栓法構(gòu)建模型成功率的因素有許多,其中小鼠體重與線栓直徑比例的匹配、品系性別的選擇、手術(shù)時(shí)間、進(jìn)線深度以及25-28℃左右的室溫是手術(shù)過(guò)程中需注意的重要因素。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),體重在25g左右的雄性KM小鼠制備MCAO模型成功率較高,適合建立小鼠局灶性腦缺血/再灌注(MCAO)

6、模型。
　　第二部分:鈣敏感受體在小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制
　　目的:
　　臨床上缺血性腦卒中的死亡率很高,其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,目前尚未明了,因此需要進(jìn)一步闡明缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制,尋找新的有效靶點(diǎn)。本文探討了鈣敏感受體(CaSR)的活化對(duì)于腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響。
　　方法:
　　線栓法構(gòu)建小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型,觀察CaSR在腦缺血再灌

7、注損傷中的作用及其機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)使用CaSR激動(dòng)劑三氯化釓(Gdcl3)以及CaSR抑制劑NPS2390進(jìn)行了干預(yù)研究。23-25g的雄性KM小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(I/R)、激動(dòng)劑組(I/R+Gdcl3)、阻斷劑組(I/R+NPS2390),每組16只。腦缺血2h再灌注22h后,對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估,TTC染色檢測(cè)腦梗死體積,HE染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化,Western Blot檢測(cè)腦組織CaSR、Bax、Bc

8、l-2、p-JNK/JNK和p-P38/P38表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積的測(cè)定:與假手術(shù)組相比,模型組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分較高,TTC染色顯示小鼠腦組織切片呈明顯的蒼白色梗死灶。與模型組相比,激動(dòng)劑組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)一步增加,其腦梗死灶面積顯著增大;而CaSR抑制劑組可降低小鼠神經(jīng)功能評(píng)分,減少腦梗死面積。
　　2.CaSR表達(dá)水平:模型組小鼠腦皮層與海馬CaSR蛋白表達(dá)水平顯著高于假手

9、術(shù)組。與模型組相比,激動(dòng)劑組小鼠腦皮層與海馬CaSR蛋白表達(dá)顯著上調(diào),而抑制劑組可顯著抑制CaSR蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　3.HE染色病理結(jié)果:假手術(shù)組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整,模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,體積縮小,胞體皺縮,部分細(xì)胞壞死,而激動(dòng)劑組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷更加顯著;抑制劑組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷有所減輕。海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷較皮層區(qū)嚴(yán)重。
　　4.腦組織Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá):
　　與假手術(shù)組相比,模型組小鼠

10、腦組織皮層和海馬區(qū)Bax表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)減少;與模型組比較,激動(dòng)劑GdCl3可進(jìn)一步上調(diào)腦組織Bax蛋白表達(dá),抑制Bcl-2蛋白表達(dá);而抑制劑NPS2390可抑制腦組織Bax的表達(dá),上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　5.腦組織中p-JNK/JNK、p-P38/P38蛋白的表達(dá):假手術(shù)組小鼠腦皮層海馬區(qū)有少量磷酸化JNK及磷酸化P38的表達(dá);模型組小鼠腦組織p-JNK、p-P38的表達(dá)水平上調(diào),CaSR激動(dòng)劑Gdcl3可顯著上調(diào)