N6對大鼠脊髓損傷后不同時間點治療的實驗觀察.pdf

1、目的：
　　研究N6（促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑）對脊髓損傷后不同時間點注射療效觀察。
　　方法：
　　統(tǒng)一采用最初由Allen,s創(chuàng)建的重物墜落法（Weight dropping,WD法）經(jīng)由NYU（NYU/MASCIS Impactor modelⅡ）脊髓碰撞器建立大鼠急性脊髓損傷模型，碰撞器重錘質(zhì)量為10g，接觸面直徑為2mm,設(shè)計打壓高度12.5mm。將SD(Sprague Dawley)大鼠隨機分為3組，每組24只

2、，共72只，即A組（對照組）：A1脊髓損傷后30min內(nèi)注射生理鹽水治療，6只；A2脊髓損傷后8h內(nèi)注射生理鹽水，6只；A3脊髓損傷后24h內(nèi)注射生理鹽水治療，6只；A4脊髓損傷后48h內(nèi)注射生理鹽水治療，6只；途徑為椎管內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔注射，生理鹽水劑量25ul。B組（加強龍組）：同樣根據(jù)不同治療時間點（30min內(nèi)，8h內(nèi)，24h內(nèi)，48h內(nèi)）分為B1，B2，B3，B4小組，每小組6只，每只注射劑量為30mg/kg,途徑為尾靜脈注射。C

3、組（N6合劑組）：同上分為C1，C2，C3，C4小組，每小組6只，每只注射劑量為25ul，注射途徑為椎管內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔注射。脊髓損傷并藥物治療后72h統(tǒng)一取材，每小組中隨機選取3只行組織包埋石蠟切片，用于HE染色，觀察脊髓損傷組織解剖結(jié)構(gòu)，水腫、變性壞死程度，炎性細(xì)胞浸潤情況等,用于免疫組化檢測神經(jīng)細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)蛋白Caspase-3表達(dá)以及原為末端缺口標(biāo)記（Tunel法）計數(shù)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)；另3只用于提取脊髓組織蛋白，SDS-Page凝

4、膠電泳法檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2,bax,Caspase-3表達(dá)量變化；比較在相同脊髓損傷的情況下，不同時間點，不同藥物治療后脊髓損傷恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化Caspase-3及Tunel陽性神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)顯示，C1、C2組陽性細(xì)胞數(shù)較C3、C4陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，P＜0.05，存在統(tǒng)計學(xué)差異；
　　2.Western-blotting結(jié)果顯示：bcl-2蛋白在C1、C2組中表達(dá)明顯增多，較C3、C4組

5、存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；caspase-3、bax蛋白則減少，同樣存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；
　　3.免疫組化及Western-blotting結(jié)果顯示：caspase-3在A1組較B1、C1增加明顯，存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　在本項研究中，通過建立大鼠急性脊髓損傷模型，檢測損傷后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化及計數(shù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，再次驗證了N6復(fù)合劑對于大鼠脊髓損傷后的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的治療作用，并認(rèn)