C-型利鈉利尿肽抑制血管鈣化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:血管組織鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變等疾病患者中共同的病理表現(xiàn)。近年研究證明血管鈣化是一個(gè)類似于骨發(fā)育的主動(dòng)的、高度可調(diào)的過程。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一些血管局部旁/自分泌的活性物質(zhì)對(duì)血管鈣化形成過程具有重要調(diào)節(jié)作用。C-型利鈉利尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是一種重要的骨生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,損傷血管或動(dòng)脈粥樣硬化病變處的血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞可以合成CNP,它可能通過自身受體局部發(fā)揮重要

2、的旁/自分泌功能。有關(guān)CNP在血管鈣化中的作用研究甚少。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室以前在整體鈣化大鼠血管和離體鈣化的血管平滑肌細(xì)胞(vascluar smooth muscle cells,VSMCs)上觀察到外源性CNP改善血管和細(xì)胞鈣化,提示CNP系統(tǒng)可作為內(nèi)源性的血管鈣化防御體系。血管鈣化時(shí)血管組織中CNP/CNP受體的變化、作用及其病理生理意義目前尚不清楚,同時(shí)CNP抑制血管鈣化的機(jī)制目前仍未闡明。
　　目的:本工作擬在維生素D3和尼古丁

3、(VDN)誘導(dǎo)的血管鈣化大鼠模型及離體培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中觀察血管組織內(nèi)源性CNP及其受體(NPR-A、NPR-B和NPR-C)的變化和外源性 CNP對(duì)血管鈣化的影響,并進(jìn)一步在離體培養(yǎng)的VSMCs中探討CNP抑制鈣化的機(jī)制。
　　方法:用肌注維生素D3和尼古丁灌胃誘導(dǎo)大鼠血管鈣化(VDN組大鼠),背部皮下埋泵CNP(500ng/kg.h)持續(xù)給藥4周。對(duì)照組動(dòng)物肌注生理鹽水和單純花生油灌胃,方法同鈣化組。兩組動(dòng)物

4、以相同飼料飼養(yǎng)4周后進(jìn)行心功能指標(biāo)檢測(cè)。取動(dòng)脈血檢測(cè)鈣含量,并摘取心臟和主動(dòng)脈血管稱重,用von Kossa染色方法檢測(cè)鈣沉積。培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用β2磷酸甘油丙酮酸鈉處理,培養(yǎng)14天后收集,檢測(cè)鈣含量并用vonKossa染色方法檢測(cè)鈣沉積;采用放射免疫分析的方法測(cè)定CNP及 cGMP含量;半定量RT-PCR的方法測(cè)定組織細(xì)胞中CNP/NPRs mRNA的表達(dá)變化情況;Real Time RT-PCR方法測(cè)定組織細(xì)胞中OPN、

5、MGP、BMP-2、cbfα-1 mRNA的表達(dá)變化;Western blot方法測(cè)定組織細(xì)胞OPN蛋白含量。
　　實(shí)驗(yàn)分組一:雄性 Sprague-Dawley大鼠(體重180~200 g)隨機(jī)分三組(每組n=10):(1)對(duì)照組(CON):給予等量生理鹽水肌注、單純花生油灌胃代替維生素D3和尼古丁;(2)血管鈣化組(VDN):實(shí)驗(yàn)第一天早上9:00給予維生素D3(300,000 IU/kg)肌注,尼古丁溶于花生油(25 mg/

6、kg,5 ml/kg),灌胃,晚18:00尼古丁重復(fù)灌胃一次;(3)血管鈣化+ C-型利鈉利尿肽組(VDN+CNP):除給予維生素D3和尼古丁同VDN組外,背部皮下埋泵(500ng/kg.h)持續(xù)釋藥4周;
　　實(shí)驗(yàn)分組二:(1)對(duì)照組(CON):普通細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)VSMCs;(2)鈣化細(xì)胞組(Cal組):培養(yǎng)液中加入10mmol/Lβ-甘油磷酸鹽;(3)Cal+H7組:在鈣化培養(yǎng)液內(nèi)加入PKG的抑制劑H7(濃度為1×10-5mo

7、l/L);(4)Cal+CNP1組:在鈣化培養(yǎng)液內(nèi)加入CNP(濃度為10-9mol/L);(5)Cal+CNP2組:在鈣化培養(yǎng)液內(nèi)加入CNP(濃度為10-7mol/L);(6)Cal+CNP+H7組:在鈣化培養(yǎng)液內(nèi)分別加入CNP(濃度為10-7mol/L)和PKG的抑制劑H7(濃度為1×10-5mol/L)。(7)CON+CNP組:正常VSMCs加入CNP(10-7 mol/L);(8)CON+CNP+H7組:正常VSMCs加入CNP(

8、10-7 mol/L)和H7(10-5 mol/L);每二日更換一次培養(yǎng)液,培養(yǎng)7天。
　　結(jié)果:1.VDN組大鼠von Kossa染色見血管組織有大量鈣鹽的沉積。與對(duì)照組相比,VDN組大鼠血管鈣含量及堿性磷酸酶活性分別升高73％和126%(P均小于0.01);血管CNP含量有所增加;鈣化血管CNP和NPR-B mRNA分別較對(duì)照組降低了16%和95.7%(P<0.05);而NPR-CmRNA的水平是對(duì)照組的21倍。MGP mRN

9、A水平較對(duì)照組高55.2%(P<0.05),BMP-2 mRNA水平是對(duì)照組的1.5倍(P<0.05)。血管OPN蛋白表達(dá)亦明顯上調(diào),為對(duì)照組的1.4倍(P<0.01)。CNP組大鼠血管總鈣含量和堿性磷酸酶活性與 VDN組相比分別降低39.2%和51.9%（P均小于0.01);MGP mRNA水平較VDN組低35.7%(P<0.05),BMP-2 mRNA水平較VDN組低64.8%(P<0.05)。血管OPN蛋白水平較VDN組低44.6

10、%(P<0.01),血管cGMP合成增加,分別較對(duì)照和VDN組升高46.8%和57.1%(P均小于0.01),提示CNP可能通過cGMP/PKG途徑防止血管發(fā)生鈣化。2.離體用β-磷酸甘油培養(yǎng)大鼠VSMCs7 d,VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換和鈣化。細(xì)胞培養(yǎng)液中CNP含量增加;von Kossa染色見細(xì)胞內(nèi)外有大量鈣鹽的沉積。Western blot顯示,發(fā)生表型轉(zhuǎn)換和鈣化的VSMCsα-actin表達(dá)明顯降低。細(xì)胞鈣含量及堿性磷酸酶活性與對(duì)

11、照組相比分別升高111.3%和80.9%(均P<0.01);鈣化的VSMCs中內(nèi)源性CNP及其受體NPRs mRNA表達(dá)水平與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致:CNP和NPR-B mRNA分別較對(duì)照組降低35.3%和64.6%(P<0.05);NPR-C mRNA的水平則較對(duì)照組增加了32.7%(P<0.05)。OPN mRNA水平較對(duì)照組高92.4%(P<0.01),BMP-2 mRNA水平是對(duì)照組的1.12倍(P<0.01),cbfα-1mRNA水

12、平較對(duì)照組低31.8%(P<0.05)。鈣化血管平滑肌細(xì)胞OPN蛋白的表達(dá)亦明顯上調(diào),是對(duì)照組的1.03倍(P<0.01)。10-9M和10-7M的CNP使細(xì)胞內(nèi)鈣含量分別降低40.4%和53.4%(均 P<0.01),ALP活性分別降低36.3%和58.3%(均P<0.01),CNP使VSMCs中骨橋蛋白(osteopontin,OPN)mRNA及蛋白水平呈濃度依賴性下調(diào),較鈣化組細(xì)胞分別下降36.4%(P<0.05)和48.3%(P

13、<0.01)。同時(shí),CNP使VSMCs中BMP-2 mRNA水平較鈣化組細(xì)胞降低33.2%(P<0.05),而 cbfα-1mRNA水平?jīng)]有明顯變化,提示 CNP可能通過下調(diào) BMP-2發(fā)揮抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)換及鈣化的作用。給予PKG阻斷劑H7對(duì)正常及鈣化VSMCs鈣含量和OPN蛋白表達(dá)沒有影響,卻明顯阻斷了CNP的作用,使鈣化VSMCs內(nèi)鈣含量增加,OPN蛋白表達(dá)升高,而CNP對(duì)正常VSMCs鈣含量和OPN蛋白表達(dá)沒有影響。Real

14、 Time RT-PCR顯示OPN、BMP-2mRNA水平較單純CNP刺激作用分別增加51.3%和53.8%(P<0.05),而cbfα-1 mRNA表達(dá)沒有變化,提示CNP可通過cGMP/PKG通路調(diào)節(jié)OPN、BMP-2mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:1.外源性CNP具有顯著抑制血管和細(xì)胞鈣化、阻止VSMCs的成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用,是治療血管鈣化的新靶點(diǎn)。2.CNP可能通過CNP-CNP受體-cGMP途徑抑制血管鈣化。3.C