PPARγ抑制CKD血管鈣化的作用和機(jī)制研究.pdf

1、慢性腎臟病(CKD)在我國(guó)及全球的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其中大部分患者最終將發(fā)展為終末期腎病(ESRD)并接受腎臟替代治療。與普通人群相比，CKD患者心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)的發(fā)生率和死亡率顯著增加，而快速進(jìn)展的血管鈣化是此類患者CVD的重要特征和致死性心血管事件的病理基礎(chǔ)，是CVD發(fā)病率和死亡率的獨(dú)立影響因子。因此，如何阻遏CKD患者血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展具有極其重要的臨床意義。
　　過氧

2、化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）是過氧化物酶體增殖物激活受體的一種亞型，主要在脂肪組織表達(dá)，可參與調(diào)控胰島素敏感性、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和脂肪生成，是噻唑烷二酮類胰島素增敏藥物的作用靶點(diǎn)。新近研究表明，PPARγ與細(xì)胞鈣磷代謝及血管鈣化有著密切的關(guān)系，并對(duì)心血管系統(tǒng)有著重要的保護(hù)作用，且其保護(hù)作用不通過調(diào)節(jié)血糖而實(shí)現(xiàn)。有研究在自發(fā)性高血壓大鼠中發(fā)現(xiàn)，其VSMCs的PPARγ表達(dá)下調(diào)，同時(shí)VSMCs表型標(biāo)志物包括收縮蛋白

3、、α-SMA和SM22α表達(dá)降低;而PPARγ激動(dòng)劑卻可以恢復(fù)VSMCs表性標(biāo)志物的表達(dá)，抑制自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)脈重塑，這說明PPAR是維持VSMCs表型的重要轉(zhuǎn)錄因子。最近，Woldt等在低密度脂蛋白受體缺陷小鼠基礎(chǔ)上制備了PPARγ血管平滑肌細(xì)胞定點(diǎn)基因敲除小鼠，給予高脂飲食后發(fā)現(xiàn)該定點(diǎn)基因小鼠血管的粥樣斑塊中出現(xiàn)了軟骨樣細(xì)胞聚積，而對(duì)照組小鼠動(dòng)脈中幾乎看不到上述表現(xiàn)。上述這些研究提示PPARγ可以穩(wěn)定VSMCs表型，拮抗血管鈣化。

4、但PPARγ是否在CKD血管鈣化中扮演重要角色，其參與血管鈣化的機(jī)制又是什么？目前國(guó)內(nèi)外并未見研究報(bào)道。因此，本研究以CKD患者鈣化血管、CKD模型小鼠、小鼠血管平滑肌細(xì)胞株(VSMCs)和Klotho基因敲除小鼠（kl/kl）為研究對(duì)象，明確PPARγ在CKD血管鈣化中的關(guān)鍵作用;闡明高磷是否通過抑制PPARγ誘導(dǎo)了VSMCs向成骨細(xì)胞分化和鈣化，并明確PPARγ拮抗高磷誘導(dǎo)血管鈣化的機(jī)制;最后觀察PPARγ激動(dòng)是否可以抑制高磷誘導(dǎo)的

5、VSMCs向成骨細(xì)胞分化和CKD血管鈣化。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　一、PPARγ在CKD患者鈣化血管中表達(dá)下調(diào)
　　經(jīng)CKD患者同意并通過倫理審查后，選取12對(duì)行腎移植手術(shù)供腎和受腎患者的腎動(dòng)脈，以及37例非透析的原發(fā)性CKD5期行動(dòng)靜脈內(nèi)瘺術(shù)患者的撓動(dòng)脈用于鈣化和免疫組織化學(xué)染色。馮庫薩染色(Von Kossa)發(fā)現(xiàn)，12例腎移植受腎患者腎動(dòng)脈均出現(xiàn)了明顯的中膜鈣化，鈣化比例為100％(12/12)而12

6、例供腎者的腎動(dòng)脈均無鈣化發(fā)生。37例CKD5期患者只有14例出現(xiàn)了明顯的撓動(dòng)脈鈣化，鈣化比例為37.83％(14/37)，這說明CKD患者似乎更易出現(xiàn)大動(dòng)脈血管鈣化。然后我們選擇鈣化和無鈣化的撓動(dòng)脈繼續(xù)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果提示，與無鈣化血管相比，鈣化血管PPARγ、Klotho、平滑肌22α(SM22α)的表達(dá)顯著下調(diào)，而成骨細(xì)胞標(biāo)志物骨形成蛋白2(BMP2)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的表達(dá)則明顯升高。臨床檢驗(yàn)結(jié)果分析

7、表明，有橈動(dòng)脈血管鈣化的CKD5期患者血磷水平（2.16±0.52mmol/L）明顯高于無血管鈣化的CKD5期患者（1.60±0.54mmol/L）(P＜0.05)，且甲狀旁腺素(PTH)水平（534.63±292.77pg/ml）也明顯高于無血管鈣化的患者（242.01±188.74pg/ml）(P＜0.01)，但eGFR和血鈣水平并沒有顯著性差異。說明高磷血癥、PTH水平，PPARγ表達(dá)下調(diào)均與CKD患者血管鈣化有著密切的關(guān)系。

8、r>　　二、CKD小鼠喂食高磷飲食后主動(dòng)脈發(fā)生中膜鈣化，并且PPARγ表達(dá)明顯降低
　　為了進(jìn)一步觀察PPARγ表達(dá)變化與CKD血管鈣化的關(guān)系，我們用DBA/2J雌性小鼠制作CKD（單腎切除+2/3腎毀損）小鼠模型，給予高磷飲食。并將小鼠分為以下4組進(jìn)行試驗(yàn):假手術(shù)+正常磷飲食組(non-CKD+ NP)、假手術(shù)+高磷飲食組(non-CKD+HP)、手術(shù)+正常磷飲食組(CKD+NP)、手術(shù)+高磷飲食組(CKD+ HP)。從造模成功

9、后，小鼠給予相應(yīng)飲食飼養(yǎng)12周后取材，取小鼠血清測(cè)定尿素氮（BUN）、鈣、磷含量，取主動(dòng)脈進(jìn)行Von Kossa染色、免疫組化、免疫熒光染色及western blot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CKD+HP組小鼠BUN和血磷均明顯增高，并出現(xiàn)主動(dòng)脈鈣化，免疫組化、免疫熒光和western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他組比較，該組小鼠PPARγ、Klotho、SM22α表達(dá)顯著降低，Runx2、BMP2表達(dá)明顯增高，其他組間無顯著性差異。這進(jìn)一步提示PPA

10、Rγ與CKD血管鈣化之間存在密切關(guān)聯(lián)。
　　三、高磷可以誘導(dǎo)VSMCs PPARγ表達(dá)下調(diào)
　　為了觀察高磷對(duì)PPARγ表達(dá)的影響，我們分別使用含有2.6mmol/L磷酸鹽的高磷培養(yǎng)基和磷含量正常的培養(yǎng)基孵育VSMCs5天。茜素紅S(Alizarin Red S)染色發(fā)現(xiàn)高磷的確誘導(dǎo)了VSMCs鈣化，而western blot結(jié)果表明高磷明顯降低了PPARγ、Klotho、和平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SM22α的表達(dá)，而Runx2、B

11、MP2蛋白表達(dá)明顯增高。上述結(jié)果證實(shí)，高磷誘導(dǎo)VSMCs向成骨細(xì)胞分化和血管鈣化的同時(shí)，下調(diào)了PPARγ的表達(dá)。
　　四、PPARγ激動(dòng)劑可以抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs向成骨細(xì)胞分化和鈣化
　　為了闡明PPARγ在高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化中的關(guān)鍵作用，我們利用PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(Rosiglitazone，RGL)預(yù)孵育VSMCs1h后，再觀察高磷對(duì)VSMCs向成骨細(xì)胞分化和鈣化的影響。實(shí)驗(yàn)分為4組:磷含量正常的對(duì)照組(NP

12、組)、含2.6mM的高磷組（HP組）、羅格列酮組（RGL組）、高磷+羅格列酮組（HP+RGL組）。各組VSMCs細(xì)胞在高磷孵育5天后，Alizarin Red S染色觀察各組細(xì)胞鈣化情況， western blot檢測(cè)PPARγ、SM22α、Runx2、BMP2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RGL預(yù)孵育可以顯著抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，并且RGL預(yù)孵育可以明顯抑制高磷誘導(dǎo)的PPARγ、SM22α蛋白表達(dá)降低和Runx2、BMP2的表達(dá)增高。這

13、說明PPARγ激動(dòng)可以明顯抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs向成骨細(xì)胞分化和鈣化。
　　五、Klotho基因沉默可以削弱PPARγ激動(dòng)劑對(duì)高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化的抑制作用
　　雖然PPARγ激動(dòng)可以抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs向成骨細(xì)胞分化和鈣化，但其作用機(jī)制并不明確。研究表明Klotho是抑血管鈣化因子，其已被證實(shí)在血管平滑肌細(xì)胞有表達(dá)，并通過下調(diào)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Pit-1)，阻遏細(xì)胞磷內(nèi)流，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化。為此，我們擬探

14、討轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ是否通過調(diào)控Klotho基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)了其抑制血管鈣化的作用。我們首先觀察了高磷預(yù)孵育對(duì)Klotho和Pit1表達(dá)的影響，再次明確高磷可以誘導(dǎo)VSMCs Klotho表達(dá)降低及Pit1表達(dá)升高。然后我們分4組進(jìn)行研究:NP組、HP組、RGL組、HP+RGL組，熒光定量PCR檢測(cè)Klotho mRNA表達(dá)，western blot檢測(cè)Klotho和Pit1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果表明，RGL預(yù)孵育可以明顯抑制高磷下調(diào)Klo

15、tho表達(dá)的作用，并降低高磷誘導(dǎo)的Pit1表達(dá)增高。在后續(xù)研究中，我們利用Klotho siRNA敲低VSMCs Klotho表達(dá)后再次觀察了PPARγ激動(dòng)劑對(duì)高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Klotho siRNA干擾后再給予RGL孵育，RGL對(duì)高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化和SM22α表達(dá)降低、Pit1、Runx2、BMP2表達(dá)增高的抑制作用則明顯削弱。這說明PPARγ可能是通過調(diào)控其下游靶基因Klotho抑制了高磷誘導(dǎo)的VSM