局部轉(zhuǎn)染C型利鈉肽基因防治血管吻合口再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分： 目的 克隆人C型利鈉肽基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步開(kāi)展C型利鈉肽基因治療作準(zhǔn)備。 方法 通過(guò)RT-PCR從人胎盤(pán)組織中克隆人C型利鈉肽基因全長(zhǎng)編碼區(qū)，將該DNA片段亞克隆至克隆載體pBS-T中，用SmaI單酶切篩選出負(fù)向插入片段，用HindllI和BamHI雙酶切將目的DNA片段定向克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1(+)中，然后用雙酶切、PCR鑒定和DNA序列測(cè)定三重鑒定方法對(duì)重組質(zhì)粒

2、進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 酶切、PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)，人C型利鈉肽基因全長(zhǎng)編碼區(qū)被準(zhǔn)確插入至pcDNA3．1(+)酶切位點(diǎn)HindlII和BamHI之間，并且未發(fā)現(xiàn)有堿基突變或移位。 結(jié)論 含人C型利鈉肽基因真核表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建并鑒定，為開(kāi)展C型利鈉肽基因治療奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第二部分： 目的 檢測(cè)重組質(zhì)粒pcDNA3．1／hCNP在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株中的表達(dá)及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的

3、作用。 方法 將pcDNA3．1／hCNP在多聚乙酰亞胺介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株，以pEGFP-C1為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)RT-PCR、免疫組化和Westernblot檢測(cè)pcDNA3．1／hCNP的表達(dá)。利用MTT方法檢測(cè)該質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。 結(jié)果 熒光顯微鏡檢測(cè)多聚乙酰亞胺的轉(zhuǎn)染效率約為60％左右，重組質(zhì)粒pcDNA3．1／hCNP在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中能

4、高效表達(dá)，CNPmRNA和CNP蛋白表達(dá)均明顯增高，MTT結(jié)果證實(shí)其表達(dá)產(chǎn)物能明顯促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。 結(jié)論 重組pcDNA3．1／hCNP在多聚乙酰亞胺介導(dǎo)下能順利轉(zhuǎn)染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞并高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能明顯促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，為下一步進(jìn)行C型利鈉肽基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第三部分： 目的 檢測(cè)重組質(zhì)粒pcDNA3．1／hCNP在大鼠髂動(dòng)脈吻合口再狹窄模型中的表達(dá)

5、及其對(duì)血管再狹窄的防治作用。 方法 將pcDNA3．1／hCNP在PEI介導(dǎo)下用腔內(nèi)加壓轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染大鼠髂動(dòng)脈吻合口再狹窄模型髂動(dòng)脈，以pEGFP-C1為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，分別用Evans'blue染色，RT-PCR，Westernblot，免疫組化和病理學(xué)檢查等方法檢測(cè)pcDNA3．1／hCNP在動(dòng)脈壁中的表達(dá)，以及血管內(nèi)皮修復(fù)、內(nèi)膜增生、血栓形成和PCNA表達(dá)等指標(biāo)。 結(jié)果 重組質(zhì)粒pcDNA3．1