轉(zhuǎn)染C型利鈉利尿肽基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖-絲素支架材料修復(fù)大鼠軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究轉(zhuǎn)染C型利鈉利尿肽（CNP）基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)復(fù)合殼聚糖/絲素支架材料對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)效果，進(jìn)一步探索軟骨缺損的修復(fù)方法。
　　方法：1、采用全骨髓培養(yǎng)法分離SD大鼠BMSCs并進(jìn)行傳代培養(yǎng)、鑒定及多向分化能力測(cè)定。2、將已構(gòu)建的含有人CNP基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因的重組腺病毒(Ad-NPPC-eGFP)按照特定轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)染BMSCs，通過(guò)流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效

2、率，Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CNP mRNA的表達(dá)情況，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs體外誘導(dǎo)21d時(shí)成軟骨情況，并進(jìn)一步通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)此時(shí)成軟骨相關(guān)基因collagenⅡ、Aggrecan及Sox9的表達(dá)情況。3、以蠶絲及殼聚糖為原料，分別制得2％絲素蛋白以及2％殼聚糖溶液，將其按50/50共混比混合，經(jīng)冷凍干燥技術(shù)得到殼聚糖/絲素支架材料。通過(guò)大體觀察、掃描電鏡

3、(SEM)觀察支架材料的特征及孔隙大小，體積法計(jì)算支架材料的孔隙率，并通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染Ad-NPPC-eGFP的BMSCs在支架材料中的增殖情況。4、將48只SD大鼠隨機(jī)分為四組：對(duì)照組(C)、單純支架組(S)、MSC/支架組(MS)、轉(zhuǎn)染CNP的MSC/支架組(CMS)，分別建立直徑1mm，深1mm的關(guān)節(jié)軟骨缺損進(jìn)行軟骨缺損的修復(fù)實(shí)驗(yàn)，C組不做任何處理，S組為在缺損部位植入殼聚糖/絲素支架材料，MS組植入復(fù)合有BMSCs的殼聚糖

4、/絲素支架材料，CMS組植入復(fù)合轉(zhuǎn)染CNP基因的BMSCs及殼聚糖/絲素支架材料，分別在4w、8w、12w處死動(dòng)物進(jìn)行軟骨修復(fù)情況大體觀察及HE染色和甲苯胺藍(lán)染色觀察，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。
　　結(jié)果：1、成功獲取了大鼠BMSCs，其形態(tài)主要表現(xiàn)為梭形、橢圓形及多角形，呈放射狀、渦旋狀生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示其高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志，成脂、成骨分化誘導(dǎo)結(jié)果表明其具有較好的多向分化能力。2、腺病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)

5、胞狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染效率較高，與對(duì)照組相比，雖然增殖略有下降，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染后BMSCs CNP mRNA高水平表達(dá)(P＜0.05)，成軟骨誘導(dǎo)21d時(shí)的阿爾新藍(lán)染色結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad-NPPC-eGFP的BMSCs體外成軟骨能力好于單純誘導(dǎo)組及轉(zhuǎn)染Ad-eGFP誘導(dǎo)組(P＜0.05);且誘導(dǎo)21d時(shí)轉(zhuǎn)染Ad-NPPC-eGFP誘導(dǎo)組成軟骨相關(guān)基因collagenⅡ、Aggrecan及Sox9的mRNA表達(dá)

6、量明顯高于單純誘導(dǎo)組以及轉(zhuǎn)染Ad-eGFP誘導(dǎo)組(P＜0.05)。3、殼聚糖/絲素支架材料呈乳白色，為多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，表面粗糙，材料上部孔隙相對(duì)較大，而底部孔隙較小。材料內(nèi)部可見(jiàn)互相交通的不規(guī)則網(wǎng)孔。材料的孔隙率在83％-90％之間，通過(guò)SEM觀察可見(jiàn)材料的上部孔隙大小在150-200μm之間，底部的孔隙大小在10-20μm之間，孔隙大小合適，熒光顯微鏡顯示細(xì)胞在植入支架材料72h后較12h時(shí)出現(xiàn)了明顯的增殖。4、成功構(gòu)建了大鼠關(guān)節(jié)軟骨