基于LC-MSn和基因轉(zhuǎn)錄組分析的白茯苓、茯苓皮三萜酸類成分差異及機(jī)理研究.pdf

1、茯苓是多孔菌科真菌(Poria cocos Wolf)的干燥菌核。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中將其列為上品。在中醫(yī)臨床中，根據(jù)入藥部位的不同，分為白茯苓（去皮的內(nèi)核）、茯苓皮（赤褐色外皮）、茯神（包裹了松根的茯苓）。三者功效不同:白茯苓偏于健脾（始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》）;茯神長于安神（始載于《名醫(yī)別錄》）;茯苓皮擅于利水（始載于《本草綱目》）。三味藥來源相同，但功效各異。原因何為？有待揭示。
　　本研究對白茯苓和茯苓皮中三萜酸化學(xué)成分進(jìn)行了定性、

2、定量的比較研究，同時對產(chǎn)生化學(xué)成分差異的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了研究，從化學(xué)成分及關(guān)鍵酶基因兩個方面探討造成茯苓皮與白茯苓功效不同的物質(zhì)基礎(chǔ)，為揭示茯苓不同藥用部位功效不同的內(nèi)在原因提供試驗(yàn)依據(jù)，也為如何科學(xué)解釋部分中藥“不同部位功效不同”的現(xiàn)象提供研究范例。
　　研究內(nèi)容如下:
　　1.茯苓三萜酸對照品的制備
　　采用多種色譜技術(shù)相結(jié)合的方法分離純化了茯苓皮及白茯苓中的14個三萜酸對照品。經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR

3、數(shù)據(jù)分析，確定了它們的結(jié)構(gòu)，分別為茯苓酸(pachymic acid)、去氫土莫酸(dehydrotumulosic acid)、3-表去氫土莫酸（3-epi-dehydrotumulosic acid）、去氫茯苓酸(dehydropachymic acid)、3-表去氫茯苓酸（3-epi-dehydropachymic acid）、多孔菌酸C(polyporenic acid C)、trametenolic acid、 dehydro

4、trametenolic acid、依布里酸(eburiconic acid)、去氫依布里酸(dehydroeburiconic acid)、茯苓新酸A(poricoic acid A)、茯苓新酸 B(poricoic acid B)、茯苓新酸 D(poricoic acid D)和5R,8R-peroxydehydrotum ulosic acid。
　　2.茯苓中羊毛甾型三萜酸質(zhì)譜裂解規(guī)律的總結(jié)
　　茯苓中羊毛甾烷型三萜

5、酸按結(jié)構(gòu)可分為4類，羊毛甾-△8型(TypeⅠ)、羊毛甾-△7,9(11)-二烯型(TypeⅡ)、3，4-開環(huán)-羊毛甾-△8型(TypeⅢ)以及3，4-開環(huán)-羊毛甾-△7,9(11)-二烯型(TypeⅣ)。采用軌道離子阱-傅里葉變化質(zhì)譜對上述對照品進(jìn)行了裂解規(guī)律研究，總結(jié)了羊毛甾烷型三萜酸質(zhì)譜裂解規(guī)律:(1)分子量的判定:在正離子檢測模式下，C3及C16有羥基取代的三萜酸易生成[M+H-18]+離子;C3羥基取代的三萜酸生成[M+H]+

6、準(zhǔn)分子離子峰;在負(fù)模式下，易生成[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。(2)化合物類型的鑒別:TypeⅠ化合物的特征離子為m/z295; TypeⅡ化合物的特征離子為m/z293;3-氧-7，9(11)-二烯型羊毛甾化合物（如多孔菌酸C）的特征離子為m/z309;在負(fù)離子檢測模式下，3，4-開環(huán)型二萜酸（TypeⅢ和Ⅳ）易生成[M-H-74]或[M-H-88]-特征碎片。(3) C17側(cè)鏈的鑒別:C9H16O2/C8H14O2(Δm=156/148

7、 Da)為羊毛甾烷型三萜酸C17側(cè)鏈的中性丟失。根據(jù)這一特征數(shù)據(jù)可確定C17側(cè)鏈的取代基類型。(4) C3取代基立體異構(gòu)的判斷:茯苓三萜酸C3取代基多有α/β異構(gòu)，當(dāng)C3的取代基處于α構(gòu)型時，碎片[M+H-C16取代基-C17取代基]+的強(qiáng)度大于碎片[M+H-C16取代基-C3取代基]+的強(qiáng)度;反之，則為C-3β取代。
　　3.茯苓皮與白茯苓中三萜酸成分的定性、定量比較
　　采用UHPLC-DAD-FT/MS法對茯苓皮和白茯

8、苓中三萜酸成分進(jìn)行了定性分析，從茯苓皮中鑒定了27個成分，白茯苓中鑒定了24個成分，包括5組同分異構(gòu)體（15個化合物），預(yù)測了4個可能的新化合物。
　　建立了7 min內(nèi)同步測定9個二萜酸成分的UHPLC-MS/MS定量分析方法，對6個產(chǎn)地的茯苓皮及白茯苓中三萜酸成分含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，白茯苓與茯苓皮中的三萜酸含量存在顯著差異(p＜0.001)，茯苓皮中9個三萜酸的含量都明顯高于白茯苓。運(yùn)用Simca-P+11軟件對上述測定

9、結(jié)果進(jìn)行PCA(Principalcomponent analysis)及PLSD(Partial least squares discriminant analysis)分析方法處理，白茯苓與茯苓皮被明顯地聚為兩類。去氫土莫酸、trametenolic acid，dehydrotrametenolic acid以及poricoic acid A對白茯苓與茯苓皮的化學(xué)成分差異貢獻(xiàn)較大。
　　4.茯苓皮與白茯苓基岡轉(zhuǎn)錄組初步研究

10、r>　　鑒于茯苓皮與白茯苓中開環(huán)型三萜酸組成存在顯著差異，本文側(cè)重于開環(huán)型三萜酸合成酶的研究。采用Illumina Hiseq技術(shù)對茯苓皮、白茯苓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。采用功能注釋及表達(dá)量差異分析對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、比對，篩選了與開環(huán)型三萜酸合成有關(guān)的酶。分別提取云南產(chǎn)6個新鮮茯苓的茯苓皮及白茯苓的總RNA，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，對產(chǎn)生3，4-開環(huán)型三萜酸的關(guān)鍵酶進(jìn)行了擴(kuò)增，采用熒光半定量的方法測定關(guān)鍵酶基因在

11、茯苓皮與白茯苓中的表達(dá)量，并測定白茯苓與茯苓皮中去氫土莫酸、多孔菌酸C及茯苓新酸B的含量，考察基因表達(dá)量與化學(xué)成分變化的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對于不同的茯苓個體，去氧土莫酸與茯苓新酸B含量與所測基因表達(dá)量變化趨勢相同;多孔菌酸C含量變化趨勢與所測基因表達(dá)量變化趨勢相反。據(jù)此推測多孔菌酸C為3，4-開環(huán)型三萜酸生物合成的底物，在關(guān)鍵酶基因的作用下產(chǎn)生開環(huán)型三萜酸。
　　綜上所述，本文首次采用UHPLC-DAD-FT/MS及UHPLC