大黃魚(yú)免疫球蛋白單抗的制備及在虹彩病毒疫苗效果評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究.pdf

1、大黃魚(yú)是中國(guó)最重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)受到各類(lèi)寄生蟲(chóng)、弧菌、假單胞以及病毒病的威脅。2005年以來(lái)，研究報(bào)道表明虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬的病毒感染各種包括大黃魚(yú)在內(nèi)的各種海水魚(yú)類(lèi)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，特別在中國(guó)東海養(yǎng)殖區(qū)域較為嚴(yán)重。疫苗將有可能成為一種效果明顯、無(wú)環(huán)境危害的虹彩病毒防控措施，但病毒疫苗的研制需建立一種有效的疫苗效果評(píng)價(jià)方法。
　　本研究采用硫酸胺沉淀法和親和柱層析法分離提取大黃魚(yú)免疫球蛋白，硫酸胺

2、沉淀法采用20-50％飽和度的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀；親和層析采用 GE公司的高效 A蛋白柱和高效 G蛋白柱直接吸附魚(yú)血清中的免疫球蛋白，結(jié)果表明A蛋白柱可從大黃魚(yú)血清直接提取純化IgM，對(duì)IgM有良好的提取回收率和良好的純度，血清不需經(jīng)預(yù)處理；而 G蛋白柱提取的大黃魚(yú) IgM與柱結(jié)合較弱，回收率差。SDS-PAGE電泳表明經(jīng) A蛋白柱提取的IgM顯示兩條帶，與大黃魚(yú)的重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）大小相對(duì)應(yīng)。
　　用純化的IgM與弗氏佐

3、劑，以0.5mg/只腹腔注射 Balb/c小鼠，首次免疫采用完全佐劑乳化(含卡介苗)，第二次起采用不完全佐劑注射，共進(jìn)行5次注射。收集免疫后小鼠血清，用大黃魚(yú)純化抗體預(yù)包被酶標(biāo)板，測(cè)定小鼠血清的ELISA滴度。小鼠血清與大黃魚(yú)抗體有良好的抗體效價(jià)，ELISA滴度達(dá)1：16000，與草魚(yú)、鯽魚(yú)和鳊魚(yú)抗體無(wú)交叉反應(yīng)，但與黑魚(yú)、鱖魚(yú)和加州鱸等鱸形目魚(yú)類(lèi)存在一定的交叉反應(yīng)。取經(jīng)大黃魚(yú)純化抗體免疫后的小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0

4、融合，用加 HAT選擇的1640培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，再用提純大黃魚(yú)IgM包被ELISA板，采用間接ELISA法篩選抗大黃魚(yú)IgM特異性抗體，單抗顯示較好的特異性，與鱸形目其他魚(yú)類(lèi)無(wú)交叉反應(yīng)。
　　收集虹彩病毒 PCR陽(yáng)性的患病大黃魚(yú)，取病毒組織，經(jīng)均勻后，離心取上清液，用10%PEG+0.5M NaCl沉淀病毒，提粗純化病毒，用此病毒包被 ELISA板，建立了測(cè)定病毒的間接ELISA法。用該法檢測(cè)虹彩病毒陽(yáng)性的患病大黃魚(yú)血清和無(wú)