抗偏頭痛中藥安天膠囊的研究和開發(fā)及天然植物中活性成分的分離和研究.pdf

1、頭痛是一種常見疾病，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，人群中頭痛的發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和工作。頭痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其作用機(jī)制尚不十分清楚。目前，國(guó)內(nèi)外臨床治療頭痛主要用解熱鎮(zhèn)痛藥、麥角生物堿、非甾體抗炎藥和5-HT 受體激動(dòng)劑對(duì)癥治療，并輔以中樞鎮(zhèn)靜藥緩解病情。中草藥在我國(guó)醫(yī)療保健中已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，中藥安天的開發(fā)源于《太平圣惠方》，由旋覆花和牛蒡子兩味中草藥組成的處方。此兩種中藥的總提物經(jīng)扭體藥理試驗(yàn)均表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛活

2、性。本課題采用現(xiàn)代化的手段，著眼于中藥有效成分的研究與開發(fā)，發(fā)掘傳統(tǒng)中藥的精華。 菊科植物旋覆花為我國(guó)藥典收載的藥用植物，作為常用中藥，具有降氣、消痰，行水，止嘔的功效。旋復(fù)花屬植物含有甾醇、倍半萜、香豆素、及類黃酮等化學(xué)成分，這些成分的生物活性研究表明旋覆花主要用于治療支氣管炎、肝炎、關(guān)節(jié)炎和抗腫瘤等。其中對(duì)倍半萜內(nèi)酯化合物抗腫瘤及抗炎活性研究報(bào)道較多，但未見有關(guān)旋覆花治療頭痛及鎮(zhèn)痛作用活性成分的報(bào)道。歐亞旋覆花廣泛分布在我國(guó)

3、東北、內(nèi)蒙古、新疆等地，但尚未見歐亞旋覆花作為旋覆花藥材使用的先例。歐亞旋覆花乙醇提取物，經(jīng)扭體、熱板、甩尾和福爾馬林舔足藥理試驗(yàn)均證明本品總提取物有鎮(zhèn)痛作用，低劑量抑制炎性疼痛，高劑量既抑制炎性疼痛又抑制神經(jīng)疼痛。這是迄今為止第一次發(fā)現(xiàn)此草藥中具有鎮(zhèn)痛作用。 本研究采用系統(tǒng)提取分離手段，建立了歐亞旋覆花多糖的提取制備及含量測(cè)定方法；制備了該藥材揮發(fā)油并對(duì)其成分進(jìn)行了GC-MS分析；分離、制備并確定了該草藥的鎮(zhèn)痛活性部位及有效成

4、分，為研究并發(fā)現(xiàn)新化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的鎮(zhèn)痛藥物以及今后對(duì)這一草藥的研究性開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 攻克癌癥是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)研究的主要目標(biāo)之一，而目前臨床采用的絕大多數(shù)抗腫瘤藥物為化學(xué)合成品。用于抗腫瘤治療的天然產(chǎn)物及其半合成代用品雖然為數(shù)不多，但一直是抗腫瘤藥物研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。紫杉醇是當(dāng)今臨床最好的治療卵巢癌的藥物，自1992年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于卵巢癌和乳腺癌的治療后，其應(yīng)用范圍現(xiàn)擴(kuò)展到皮膚、肺、腦和頸部等惡性腫瘤。阻礙紫杉醇臨床抗腫瘤

5、應(yīng)用的主要障礙是天然來(lái)源匱乏。紫杉醇在紅豆杉樹木中的含量很低，收率也僅有0.006～0.007％。為此，保護(hù)藥用資源，避免耗竭，研究、尋找其天然或半合成代用品是該領(lǐng)域的重點(diǎn)之一。日本紅豆杉(Taxus cuspidata)的研究始于二十世紀(jì)六十年代，已有超過(guò)200個(gè)倍半萜類紫杉烷成分發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，其中包括紫杉醇和紫杉醇半合成原料10—DAB。1992年在加拿大紅豆杉(Taxus canadenes)針葉中發(fā)現(xiàn)一紫杉烷成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與紫杉醇

6、的骨架結(jié)構(gòu)近似，并以此化學(xué)成分為原料合成了紫杉醇。在加拿大魁北克省也生長(zhǎng)著常青灌木日本紅豆杉。 本研究對(duì)加拿大產(chǎn)日本紅豆杉針葉的紫杉烷成分進(jìn)行了研究，分析其作為紫杉醇類抗腫瘤藥新天然來(lái)源的可行性。 第一部分抗偏頭痛中藥安天膠囊的制備工藝研究 目的：在已有的藥理活性研究基礎(chǔ)上，建立安天膠囊劑制備工藝，克服水煎劑的劑量標(biāo)準(zhǔn)不明確，服用、攜帶不便等缺點(diǎn)。 方法：(1)提取方法：歐亞旋覆花醇提水沉；牛蒡子水提醇沉

7、。濾液合并，制粉裝膠囊。(2)工藝條件優(yōu)化：采用正交試驗(yàn)，以浸膏得率、有效成分含量及扭體抑制率等為指標(biāo)，考察提取溶劑、提取時(shí)間和次數(shù)等關(guān)鍵因素。(3)優(yōu)選的制備工藝經(jīng)中試放大，驗(yàn)證工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。 結(jié)果：旋覆花提取工藝為10倍量95％乙醇提取三次，每次一個(gè)小時(shí)，醇提液濃縮后，水沉除雜。牛蒡子提取工藝為10倍量水提取三次，每次一個(gè)小時(shí)，濃縮水提液用90％乙醇醇沉除雜，濾液合并干燥制粉裝膠囊。 結(jié)論：本研究在傳統(tǒng)中藥湯劑

8、的基礎(chǔ)之上，通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)新中藥制劑的制備工藝進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。采用有效成分和藥理學(xué)試驗(yàn)雙重控制因子，對(duì)生產(chǎn)工藝立體監(jiān)控，改進(jìn)了傳統(tǒng)古方的提取方法，創(chuàng)新性采用不同方法，分別提取的新工藝，用現(xiàn)代化定量檢測(cè)手段規(guī)范中藥的制備，改善了中藥湯劑的不穩(wěn)定和盲目性，實(shí)現(xiàn)了中藥的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選出安天膠囊劑的制備工藝，安全有效且穩(wěn)定性好，成本低廉，已報(bào)批國(guó)家中藥新藥。 第二部分歐亞旋覆花中多糖、揮發(fā)油、及倍半萜類活性化合物的

9、研究 目的：本研究旨在通過(guò)制備歐亞旋覆花多糖、揮發(fā)油、鎮(zhèn)痛活性部位和倍半萜類活性化合物，建立多糖的制備和含量測(cè)定方法；在制備分離揮發(fā)油的基礎(chǔ)上，用GC-MS對(duì)山西運(yùn)城地區(qū)產(chǎn)歐亞旋覆花揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析和鑒定；采用先進(jìn)的提取分離技術(shù)和波譜學(xué)鑒定手段，結(jié)合鎮(zhèn)痛藥理試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分離并確定鎮(zhèn)痛活性部位及成分，為添補(bǔ)這一草藥藥學(xué)研究上的空白和全方位研究并開發(fā)這一古老藥用資源奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：(1)歐亞旋覆花多糖：95％乙醇脫

10、脂后，干燥植物用水提取兩次，濾液濃縮后，取上清液加無(wú)水乙醇沉淀，沉淀物經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干燥后得歐亞旋覆花多糖，運(yùn)用苯酚—硫酸法測(cè)定其含量。(2)揮發(fā)油：采用水蒸氣蒸餾法從歐亞旋覆花中提取揮發(fā)油，用歸一化法測(cè)定成分含量。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，確定出歐亞旋覆花揮發(fā)油中的化學(xué)成分。色譜條件：DB．5石英毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm，膜厚0.25gm)；柱溫：70℃(保持2min)，以10℃/min升到230℃(保持10min)；進(jìn)樣

11、口溫度250℃；分流比15：1；載氣(He)流速為1.0ml/min。(3)鎮(zhèn)痛活性部位：干燥的歐亞旋覆花地上部分，用95％乙醇浸提4次，每次2天，濾液減壓濃縮，將醇提物懸浮于水中，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取物經(jīng)干燥后，經(jīng)小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)確定鎮(zhèn)痛活性部位。(4)倍半萜類活性化合物：具有鎮(zhèn)痛活性的氯仿部分經(jīng)閃式柱層析和加壓柱層析分離制備倍半萜類活性成分，產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)用波譜學(xué)方法檢測(cè)鑒定。 結(jié)論：本文首次研究了歐亞旋

12、覆花總多糖和揮發(fā)油的制備及分析方法，乙醇—水提取多糖效果較好，苯酚—硫酸法含量測(cè)定方法可行。水蒸氣蒸餾法制備揮發(fā)油，方法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，適于歐亞旋覆花揮發(fā)油化學(xué)成分分析，上述產(chǎn)品的生物活性有待今后進(jìn)一步研究。本文首次報(bào)道了歐亞旋覆花的鎮(zhèn)痛活性，并深入研究和確定了鎮(zhèn)痛活性部位及活性成分，即氯仿部分和1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯。采用色譜分離技術(shù)，以該山西產(chǎn)歐亞旋覆花地上部分為原料建立了該成分作為化學(xué)對(duì)照品的提取、分離、精制的制備方法，分

13、離制備的1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯已用于旋覆花新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。作為鎮(zhèn)痛活性有效成分該化合物有關(guān)抗炎作用的分子生物學(xué)研究已發(fā)表在國(guó)際雜志上，其偏頭痛作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。作為首次在歐亞旋覆花中發(fā)現(xiàn)治療頭痛及鎮(zhèn)痛作用活性物質(zhì)，我們申報(bào)了苯并呋喃酮類(即倍半萜內(nèi)酯類)及其衍生物鎮(zhèn)痛作用的國(guó)家專利(專利號(hào)ZL02117985.9)。 第三部分加拿大魁北克產(chǎn)日本紅豆杉針葉中紫杉烷化學(xué)成分的研究 目的：本研究以加拿大產(chǎn)日本紅

14、豆杉針葉為研究對(duì)象，采用先進(jìn)的提取分離手段和新技術(shù)，對(duì)其針葉中紫杉烷化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離和波譜學(xué)鑒定，并比較日本產(chǎn)紅豆杉針葉中紫杉烷成分的報(bào)道，尋找新的化合物并考察該植物作為新的紫杉醇藥用資源的可行性。 方法：生長(zhǎng)在加拿大魁北克的日本紫杉干燥針葉經(jīng)粉碎后，室溫下用甲醇浸提三次，每次24h，濾液合并濃縮后，浸膏懸浮于飽和鹽水中，先用正己烷脫脂，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，經(jīng)干燥后，減壓回收溶劑。二氯甲烷部分的化學(xué)成分的分離采用反

15、復(fù)柱層析色譜和制備、半制備高效液相色譜等分離手段，薄層層析色譜、分析高效液相色譜和NMR波譜檢測(cè)手段，分離并鑒定紫杉烷化學(xué)成分。 結(jié)論：加拿大魁北克產(chǎn)日本紅豆杉的紫杉烷成分確實(shí)與日本紅豆杉存在一定差異，在已鑒定結(jié)構(gòu)的紫杉烷中12個(gè)化合物是首次從日本紫杉中分離得到，它們是2—去乙酰氧基一紅豆杉素J(4)，9，10-deacetyltaxinine(8)，5-cinnamoyl-9，10-diacetyltaxicin Ⅰ(2-de

16、acetyltaxinine)(9)，yunnanxane(12)，5a-cinnamoyloxy-9α，10β，13α-triacetoxytaxa-4(20)，11-diene(13)，2，10-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin Ⅱ(14)，Taxine B(16)，10-deacetyltaxinine B(19)，20-cinnamoyloxy-5-epi-canadensene(22)，2α，

17、10β-diacetoxy-1β，9α-dihydroxy-5a-cinnamoyoxy-3，11-cyclotaxa-4(20)-dien-13-one (25)，1β，2α，9α，10β-tetrahydroxy-5a-cinnamoyoxytaxa-4(20)，11-dien-13-one(28)，7-epi-10-deacetyltaxol(29)?？s環(huán)taxinine A(7)為在日本紫杉中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)不穩(wěn)定新型紫杉烷天然產(chǎn)物；