改良鈦支架人工角膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 研究與評(píng)估改良鈦支架人工角膜的生物相容性和角膜生物愈合的過(guò)程；探討制作這種新型人工角膜的方法。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察改良后其生物相容性是否增加，觀察臨床表現(xiàn)和并發(fā)癥，并取材檢測(cè)MMP-2、TIMP-2在兔角膜組織的表達(dá)，探討角膜溶解并發(fā)癥的機(jī)理，為臨床治療提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.設(shè)計(jì)及制備改良鈦支架人工角膜；采用噴砂(SB)工藝預(yù)處理人工角膜鈦支架，使其表面變粗糙，然后用酸堿兩步法在人工角膜鈦支架

2、表面快速沉積羥基磷灰石(HA)涂層，改良的人工角膜鈦支架(HA/SB-Ti)外型由二襻改為三襻。采用美國(guó)Lambda Research Corporation開發(fā)的光學(xué)設(shè)計(jì)軟件OSLO，按照幾何光學(xué)原理設(shè)計(jì)人工角膜的鏡柱，用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate PMMA)為原料按設(shè)計(jì)好的圖紙手工磨制。XRD和SEM分析涂層成分、表面形貌。
　　 2.將18只正常新西蘭白兔及18只新西蘭白兔角膜堿燒傷模

3、型隨機(jī)分為3組，其中1組、2組右眼角膜基質(zhì)層內(nèi)分別植入人工角膜支架HA/SB-Ti、SB-Ti，第3組僅做角膜板層切口而不植入支架為手術(shù)對(duì)照組，另取兩只正常白兔作空白對(duì)照。術(shù)后裂隙燈觀察角膜水腫及新生血管產(chǎn)生情況，同時(shí)觀察支架的存留時(shí)間和并發(fā)癥。術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月取材，石蠟包埋后，行HE染色光鏡下觀察支架與組織界面愈合情況；2.5％戊二醛內(nèi)固定后，透射電鏡觀察支架植入后對(duì)角膜組織的影響；支架取出后，SEM觀察材料表面組織貼附情況及HA涂

4、層存留情況。
　　 3.二期植入改良鈦支架人工角膜鏡柱，觀察人工角膜植入后臨床反應(yīng)及并發(fā)癥，于1個(gè)月、3個(gè)月取材，石蠟包埋后，行免疫組織化學(xué)檢測(cè)MMP-2、TIMP-2在不同組別的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)MMP-2、TIMP-2 mRNA在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)；免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)MMP-2、TIMP-2mRNA產(chǎn)物在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.支架經(jīng)噴砂工藝后表面變粗糙，浸入SC

5、S溶液中，表面沉積了致密的羥基磷灰石涂層，涂層由疏松的片狀外層及密集的內(nèi)層組成。酸堿兩步法處理噴砂后的樣品避免了機(jī)械打磨，其形狀保持良好，且其表面涂層晶體尺寸大，生長(zhǎng)充分，外型的三襻結(jié)構(gòu)及表面的涂層均增加了支架的表面積，使支架與組織的界面變大，增加了支架的牢固性。改良人工角膜鏡柱的直徑為3.2mm、厚度為3.8 mm、前表面曲率半徑為8.874 mm。
　　 2.臨床觀察：人工角膜支架植入術(shù)后均不同程度地出現(xiàn)角膜水腫和新生血管。

6、角膜水腫于術(shù)后1周內(nèi)逐漸消退，有一例植入SB-Ti支架堿燒傷模型出現(xiàn)角膜溶解的并發(fā)癥。術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月取材，組織學(xué)檢查見HA/SB-Ti組界面處成纖維細(xì)胞數(shù)多于SB-Ti組，術(shù)后1個(gè)月時(shí)材料/組織界面處仍有炎癥細(xì)胞存在。拉出試驗(yàn)測(cè)定HA/SB-Ti支架植入角膜3月后的剪切力較SB-Ti支架增強(qiáng)(P<0.05)。SEM檢查見：鈦支架被細(xì)胞外基質(zhì)包裹，HA/SB-Ti支架表面有一層致密物質(zhì)存在，細(xì)胞外基質(zhì)在HA表面伸展良好，與HA貼附緊密

7、，而SB-Ti組支架細(xì)胞附著量明顯少。堿燒傷植入支架組中支架表面沉著的細(xì)胞外基質(zhì)少于正常角膜植入支架組。TEM檢查見：HA/SB-Ti支架與SB-Ti支架植入術(shù)后，支架周圍的膠原纖維束紊亂，角膜基質(zhì)有大量成纖維細(xì)胞，HA/SB-Ti組角膜越靠近支架中心的成纖維細(xì)胞核越圓，核仁清晰，胞漿豐富，代償增強(qiáng).堿燒傷模型組角膜基質(zhì)中膠原纖維出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，較正常兔角膜組愈合延遲。
　　 3.人工角膜鏡柱二期植入后，3周后結(jié)膜充血、角膜水腫癥

8、狀消失，植入改良鈦支架人工角膜的動(dòng)物未出現(xiàn)角膜溶解等并發(fā)癥，1月、3月各組取材，做免疫組織化學(xué)檢查，堿燒傷模型HA/SB-Ti支架植入組1月、3月MMP-2表達(dá)的平均光密度較SB-Ti支架植入組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；而3月時(shí)TIMP-2表達(dá)的平均光密度HA/SB-Ti支架較SB-Ti支架無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；正常動(dòng)物模型HA/SB-Ti支架植入組1月、3月MMP-2、TIMP-2表達(dá)的平均光密度較SB-Ti支架植入組表達(dá)

9、弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；于2周、1月、3月、5月取材后，做RT-PCR、Western blot檢測(cè)，MMP-2mRNA及MMP-2mRNA表達(dá)產(chǎn)物從支架植入開始升高，1月達(dá)到高峰，然后開始下降，除2周與3月MMP-2mRNA表達(dá)產(chǎn)物比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TIMP-2mRNA及TIMP-2mRNA表達(dá)產(chǎn)物則開始有波動(dòng)，然后逐漸升高，各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

10、
　　 結(jié)論：
　　 1.改良的人工角膜支架增加了表面的空隙率和表面積，增強(qiáng)了人工角膜在角膜中的固定。
　　 2.與單純噴砂Ti支架相比，改良的支架增加了兔角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞在其表面的粘附、伸展、增殖和分化的能力，促進(jìn)了材料與組織界面的愈合，更適應(yīng)角膜的微環(huán)境。
　　 3.改良人工角膜鈦支架的活性鱗片狀表面對(duì)抑制角膜組織中MMP-2過(guò)度表達(dá)與激活有積極作用，MMP-2、TIMP-2的表達(dá)在改良鈦支架人工角