Apelin-13動態(tài)調控內質網應激相關凋亡信號通路保護心肌缺血灌注損傷及其機理的實驗研究.pdf

1、內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)是多種原因導致大量末折疊、錯誤折疊的蛋白質在內質網大量堆積，擾亂了正常內質網的穩(wěn)態(tài)并誘發(fā)了內質網的應激。在內質網的應激早期，．細胞通過相應的未折疊的蛋白質信號反應以清除內質網堆積過多未成熟蛋白以恢復內質網的穩(wěn)態(tài)。然而，在持久的和/或嚴重的內質網應激狀態(tài)下內質網應激依賴的細胞凋亡信號通路就被激活并導致細胞死亡。內質網應激參與了哺乳動物的各種病理生理過

2、程。在心血管系統，內質網應激參與了包括心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭、動脈硬化等病理生理過程。
　　 Apelin是G蛋白偶聯受體APJ的配體，Apelin/APJ信號通路通過拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，PASS)發(fā)揮心肌保護作用，并可明顯改善心肌功能。表明其具有重要的生物學效應。本研究利用大鼠心臟在體缺血再灌注模型，旨在研究：1）進一步闡明內質網應激

3、信號通路動態(tài)改變與心肌缺血再灌注損傷的程度密切相關；2）Apelin通過改善內質網應激及抑制其相應的凋亡信號通路而減少再灌注損傷、減少心肌梗死面積：3）初步探討PI3k/Akt，ERK1/2，AMPK以及eNOS信號通路在apelin心肌保護作用機理中的價值。
　　 第一部分、時相依賴性內質網應激信號通路激活導致缺血再灌注損傷心肌梗死面積的動態(tài)改變
　　 目的：既往研究大多關注缺血再灌注損傷心肌梗死早期（某一時間點）改變

4、，而未能進一步動態(tài)觀察研究動態(tài)變化及其與內質網應激間的相互關聯。為此本研究旨在動態(tài)觀察再灌注時相2h，12h以及24h的心肌梗死面積以及ER Stress相關信號通路的活性變化。
　　 方法：建立在體大鼠缺血再灌注模型，即冠脈缺血30分鐘后，將大鼠分為：IR2小時組、IR12小時組、IR24小時組：另設一組IRO小時組和假手術組（共5組）。分別觀察內質網應激標志物活性改變、心肌細胞凋亡和心肌梗死面積變化。
　　 結果：隨

5、著再灌注時間的延長，心肌梗死面積逐漸增加，缺血30分鐘，心肌梗死面積從再灌注2小時的34.85±6.52％上升到12小時的48.98±16.22%，而從IR12小時到24小時心肌梗死面積無明顯增加(48.98±3.35% vs.50.56±3.24%)。與心肌梗死面積的增加相伴隨的是從再灌注2小時到12小時內質網應激標志物CHOP的表達、caspase-12和JNK的活性顯著增加，分別增加了2.49倍、3.38倍和2.09倍（P分別<0

6、.05）；梗死周邊區(qū)caspase3的活性和凋亡心肌細胞百分比也分別比2小時增加了2.6倍和2.5倍（P分別<0.05）。相反，ER Stress相應的凋亡信號通路CHOP、caspase-12和JNK的活性，caspase3活性和凋亡心肌細胞百分數在IR24小時卻較IR12小時下降(P<0.05)。
　　 結論：1．缺血再灌注損傷心肌梗死面積呈時間依賴性的動態(tài)變化：2．該心肌梗死面積變化與內質網應激相關凋亡信號通路激活相關。<

7、br>　　 第二部分、Apelin通過改善內質網應激減少缺血再灌注損傷心肌梗死面積
　　 目的：既往研究表明Apelin/APJ信號通路參與了缺血再灌注損傷心肌的保護，本研究旨在研究apelin是否通過改善內質網應激而發(fā)揮缺血再灌注損傷心肌的保護。
　　 方法：通過在體結扎心臟左冠脈前降支，30分鐘恢復冠脈血流建立在體大鼠缺血再灌注模型。1）將大鼠分為單純缺血再灌注損傷組(IRI)：2)IRI大鼠給予小劑量apelin

8、(0.1ug/Kg)組；3）IRI大鼠給予中等劑量apelin(lug/Kg)組；4）IRI大鼠給予大劑量apelin(lOug/Kg)組。于再灌注2小時分別測定心肌梗死面積，描述apelin心肌保護作用的劑量依賴性藥理效應。
　　 選擇最佳apelin劑量，將缺血再灌注大鼠分為：1）IRI組和2）IRl+apelin組。兩組大鼠分別于IR2小時、12小時、IR24小時觀察內質網應激標志物GRP78表達和ER Stress相關信

9、號通路的活性變化、梗死周邊區(qū)凋亡心肌細胞和心肌梗死面積變化。另設一假手術組在再灌注2小時觀察相同指標。
　　 結果：1）apelin保護再灌注損傷心肌呈劑量依賴性，即1ug/Kg劑量保護心肌作用明顯好于0.1ug/Kg組和lOug/Kg組；2）該劑量組apelin不僅減少了再灌注2小時的心肌梗死面積(35.26±2.45% vs.IRI組，18.96±2.68%;P

10、6±3.05% vs.IRI組，24.01±3.50%P<0.05)：同時，與IRI組相比較apeIin完全抑制了在再灌注2小時時CHOP、caspase-12和JNK的激活，也明顯抑制了這些ER Stress相關的凋亡信號通路活性在12和24小時進一步增高，這一保護作用與梗死周邊區(qū)caspase-3活性以及凋亡心肌細胞百分比改變一致。
　　 結論：1.apelin保護缺血再灌注損傷心肌呈劑量依賴性，即lug/Kg顯示最佳療效；

11、2.apelin通過調控內質網應激誘導的凋亡信號通路在2小時完全抑制內質網應激而保護心肌，在再灌注24小時仍然明顯改善內質網應激因而可減少心肌梗死面積的增加。
　　 第三部分、PI3K/Akt，ERK，AMPK以及eNOS信號通路參與了apeIin調控內質網應激相關調往信號通路而減少心肌缺血再灌注損傷
　　 目的：PI3K/Akt，ERK，AMPK以及eNOS信號通路激活可保護心肌，本研究旨在探討這些信號通路是否參與ap

12、elin調控內質網應激信號通路以減輕缺血再灌注損傷。
　　 方法：將心肌缺血再灌注的大鼠分為：假手術組、對照組、apelin干預組；另有IR對照和IR+apelin組分別給予LY294002(IR+LY294002和IR+apelin+LY294002)、PD98059(IR+ PD98059和IR+apelin+PD98059)、Compound C(IR+CompoundC和IR+apelin+Compou ndC)和L-N

13、AME(IR+ L-NAME和IR+apelin+L-NAME)治療以分別阻斷Akt、ERK、AMPK和eNOS活性，驗證他們在apelin治療機理中的作用價值。
　　 結果：1）在缺血/再灌注30分鐘，apelin增加了P-Akt,P-ERK、P-AMPK、P-eNOS的活性；2）LY294002和Compound C均抑制了P-Akt、AMPK、P-eNOS的激活，而不影響ERK活性：而L-NAME和PD98059則分別抑制

14、了P-eNOS、P-ERK的活性，但對Akt、AMPK活性沒有明顯影響；3）Akt、AMPK、eNOS、ERK的抑制劑均可以完全阻斷apelin在灌注損傷2小時的保護作用，并出現心肌梗死面積范圍逆轉：而在再灌注24小時時apelin減少心肌梗死面積的保護現象也可部分被這些阻斷劑所阻斷：4）這些時相依賴性反應的變化和再灌注時相2小時和24小時apelin對CHOP、caspase-12和JNK的活性調控作用相符合。
　　 結論：1