心肌缺血／再灌注損傷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-炎癥機(jī)制及環(huán)磷酰胺的保護(hù)作用.pdf

1、本文從以下兩部分進(jìn)行了闡述。
　　第一部分環(huán)磷酰胺保護(hù)心臟缺血/再灌注損傷的機(jī)制研究。
　　目的與背景:
　　炎癥在心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，但目前尚不清楚抗炎治療對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的療效。環(huán)磷酰胺是一種免疫抑制劑，它具有廣泛的抗炎癥作用，多年以來(lái)被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕病及其他與自身免疫相關(guān)疾病的治療，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎臟疾病、以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。我們推測(cè)應(yīng)用環(huán)磷酰胺進(jìn)行抗炎治療可能有

2、益于減輕心肌缺血/再灌注損傷。
　　方法:
　　在大鼠原位心臟缺血/再灌注模型上，探討小劑量環(huán)磷酰胺對(duì)心臟缺血/再灌的保護(hù)作用及可能機(jī)制。先缺血30分鐘，繼以再灌注3，12和24小時(shí)。術(shù)前于腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺（0.75g/m2，干預(yù)組）或2ml生理鹽水（對(duì)照組）。實(shí)驗(yàn)分為3組:假手術(shù)組，缺血/再灌注損傷組和環(huán)磷酰胺干預(yù)組。假手術(shù)組在術(shù)中不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)心臟缺血/再灌注損傷過(guò)程。測(cè)量血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌梗死面積、

3、心肌病理?yè)p傷程度、外周血高敏C-反應(yīng)蛋白水平、腫瘤壞死因子α濃度，并用免疫組化法檢測(cè)心肌腫瘤壞死因子α水平。
　　結(jié)果應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　與缺血/再灌注損傷組比較，環(huán)磷酰胺干預(yù)組明顯改善左心室收縮壓(LVSP)。在再灌注3小時(shí)為88.3±3.8 mmHg，但缺血/再灌注損傷組為68.6±3.8mmHg，P＜0.01;再灌注12小時(shí)為92.0±3.8 vs63.7±4.9mmHg，P＜0.01;

4、再灌注24小時(shí)為90.4±4.0 vs64.2±4.9mmHg，P＜0.01。環(huán)磷酰胺干預(yù)組左室舒張末壓(LVEDP)及左室壓力上升變化最大速率（+dp/dtmax）也有所改善。在再灌注3小時(shí)，左室舒張末壓在環(huán)磷酰胺干預(yù)組為14.57±0.94mmHg，在缺血/再灌注損傷組為14.45±0.48mmHg，P＞0.05;再灌注12小時(shí)為13.00±0.88 vs15.13±0.88mmHg，P＜0.05;再灌注24小時(shí)為13.24±0.7

5、9 vs15.50±0.81mmHg，P＜0.05。在再灌注3小時(shí)，+dp/dtmax在環(huán)磷酰胺干預(yù)組為4675.8±342.4，而在缺血/再灌注損傷組為3477.0±342.4mmHg/s，P＜0.05;再灌注12小時(shí)為5094.3±342.4 vs5182.7±442.0mmHg/s，P＞0.05;再灌注24小時(shí)為4992.6±300.3 vs3608.7±326.5mmHg/s，P＜0.05。但環(huán)磷酰胺治療不影響左室壓力下降變化最

6、大速率（-dp/dtmax）的數(shù)值。
　　應(yīng)用環(huán)磷酰胺后心肌梗死面積也顯著減少。在再灌注3小時(shí)，在環(huán)磷酰胺干預(yù)組為26.1±0.4％，而在缺血/再灌注損傷組為40.4±0.4％，P＜0.01;再灌注12小時(shí)為21.6±0.4％ vs49.9±0.4％，P＜0.01;再灌注24小時(shí)為21.6±0.4％ vs40.0±0.4％，P＜0.01。
　　心肌病理?yè)p傷評(píng)分在環(huán)磷酰胺干預(yù)組也顯著降低。在再灌注3小時(shí)，在環(huán)磷酰胺干預(yù)組為1.

7、83±0.14，而在缺血/再灌注損傷組為2.17±0.14，P＜0.01;在再灌注12小時(shí)為2.33±0.14 vs3.17±0.14，P＜0.01;再灌注24小時(shí)為2.83±0.14 vs3.83±0.14，P＜0.01。環(huán)磷酰胺干預(yù)組心肌中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，在再灌注3小時(shí)，環(huán)磷酰胺干預(yù)組為6.9±2.7/HPF，而在缺血/再灌注損傷組為20.4±1.5/HPF，P＜0.01;再灌注12小時(shí)為18.6±2.8 vs37.5±3.6

8、/HPF，P＜0.01;再灌注24小時(shí)為16.8±2.5 vs58.8±5.0/HPF，P＜0.01。
　　血清高敏C-反應(yīng)蛋白在環(huán)磷酰胺干預(yù)組也明顯降低。再灌注3小時(shí)，環(huán)磷酰胺干預(yù)組為29.3±0.5，而缺血/再灌注損傷組為32.3±0.5ng/ml，P＜0.01;再灌注12小時(shí)為29.1±0.5vs31.8±0.5ng/ml，P＜0.01;再灌注24小時(shí)為28.6±0.5 vs31.9±0.5ng/ml, P＜0.01。

9、>　　環(huán)磷酰胺干預(yù)組血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)也減少。再灌注3小時(shí)，環(huán)磷酰胺干預(yù)組血清腫瘤壞死因子α為13.3±2.6 pg/mL，而缺血/再灌注損傷組為14.1±6.0 pg/mL，P＜0.05;再灌注12小時(shí)為10.1±2.7 vs12.5±5.0 pg/mL，P＜0.05;再灌注24小時(shí)為10.4±5.6 vs13.0±3.6 pg/mL，P＜0.05。免疫組化檢測(cè)心肌TNF-α，其染色密度分別為，再灌注3小時(shí)，環(huán)磷酰胺

10、干預(yù)組為2.42±0.38，而缺血/再灌注損傷組為3.33±0.36，P＜0.01;再灌注12小時(shí)為3.75±0.52 vs5.08±0.58，P＜0.01;再灌注24小時(shí)為6.50±0.45 vs8.08±0.80，P＜0.01。
　　結(jié)論:
　　環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠原位心臟缺血/再灌注損傷有確切的保護(hù)作用，同時(shí)還帶來(lái)心肌腫瘤壞死因子α及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的減少，以及血清炎癥指標(biāo)高敏C-反應(yīng)蛋白及腫瘤壞死因子α明顯下降。我們認(rèn)為環(huán)磷

11、酰胺的心肌保護(hù)作用至少部分與其抗炎癥作用有關(guān)。
　　第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-未折疊蛋白反應(yīng)在心臟缺血/再灌注損傷時(shí)的作用。
　　目的與背景:
　　在心肌缺血/再灌注時(shí)，存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其中間過(guò)程及信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚。其他領(lǐng)域的研究提示，各種相應(yīng)的刺激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，經(jīng)兩個(gè)參與炎癥反應(yīng)的信號(hào)分子NF-κb和JNK介導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥轉(zhuǎn)錄因子及各種炎癥因子的表達(dá)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使細(xì)胞損傷加重。我們推測(cè)在心肌缺血

12、/再灌注導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，NF-κb起著重要的作用
　　方法:
　　在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型上，觀察心肌缺氧/復(fù)氧所引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，NF-κb的作用。將原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)行缺氧12小時(shí)和復(fù)氧12小時(shí)處理，實(shí)驗(yàn)分五組，(1)空白對(duì)照組（Control組）;(2)衣霉素組（Tm組，即陽(yáng)性對(duì)照組，含衣霉素1mg/L）;(3)缺氧/復(fù)氧組(H/R組，缺氧12h，再?gòu)?fù)氧12h);(4)衣霉素+

13、SN50組（Tm+SN50組，含衣霉素1mg/L，SN5050μg/ml）;(5)缺氧/復(fù)氧+SN50組（H/R+SN50組，含SN5050μg/ml）。采用Western blot法測(cè)定GRP78蛋白含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GRP78 mRNA表達(dá)情況，CCK-8(CellCounting Kit-8)法檢測(cè)心肌細(xì)胞增殖及活性水平，流式細(xì)胞儀測(cè)量腫瘤壞死因子α濃度，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及搏動(dòng)情況，蘇木素伊紅（HE）染色后觀察

14、心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　心肌缺氧/復(fù)氧后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78有升高，在使用NF-κb抑制劑SN50組，GRP78下降。以GRP78/GAPDH代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78水平。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在空白對(duì)照組（Control組）GRP78/GAPDH為0.80±0.02，衣霉素組（Tm組）為1.84±0.11，缺氧/復(fù)氧組（H/R組）1.44±0.02，衣霉素

15、+SN50組（Tm+SN50組）為1.12±0.07，缺氧/復(fù)氧+SN50組（H/R+SN50組）為1.16±0.12。其余各組與對(duì)照組相比，p＜0.01;衣霉素+SN50組與衣霉素相比，p＜0.05;缺氧/復(fù)氧+SN50組與缺氧/復(fù)氧組相比，p＜0.05。
　　心肌缺氧/復(fù)氧后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78 mRNA升高，在使用NF-κb抑制劑SN50組，GRP78 mRNA下降。RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在空白對(duì)照組（Contro

16、l組）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78 mRNA為0.28±0.06，衣霉素組（Tm組）為12.91±2.08，缺氧/復(fù)氧組（H/R組）6.91±0.81，衣霉素+SN50組（Tm+SN50組）為4.66±0.38，缺氧/復(fù)氧+SN50組（H/R+SN50組）為1.95±0.86。Tm組最高，H/R組次之，加用SN50后均顯著降低。其余各組與對(duì)照組相比，p＜0.01;衣霉素+SN50組與衣霉素相比，p＜0.05;缺氧/復(fù)氧+SN50組與缺氧/復(fù)

17、氧組相比，p＜0.05。
　　心肌缺氧/復(fù)氧后，炎癥因子TNF-α有升高，在使用NF-κb抑制劑SN50組，TNF-α下降。在空白對(duì)照組(Control組)TNF-α為2.10±0.54，衣霉素組（Tm組）為10.50±0.54pg/ml，缺氧/復(fù)氧組（H/R組）11.70±1.31 pg/ml，缺氧/復(fù)氧+SN50組(H/R+SN50組)為8.10±1.12 pg/ml。其余各組與對(duì)照組相比，p＜0.01;缺氧/復(fù)氧+SN50組

18、與缺氧/復(fù)氧組相比，p＜0.05。
　　心肌缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌損害程度的評(píng)估及SN50的作用。我們采用二個(gè)指標(biāo)評(píng)估心肌損害的程度，即測(cè)定CCK-8及心率計(jì)數(shù)。CCK-8測(cè)定及心率計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，心肌缺氧/復(fù)氧后存在心肌損害，SN50使用后可減輕心肌損害。在空白對(duì)照組(Control組)，CCK8為1.61±0.03，衣霉素組（Tm組）為0.74±0.08，缺氧/復(fù)氧組（H/R組）為0.81±0.06，衣霉素+SN50組（Tm+SN50組）

19、為0.95±0.06，缺氧/復(fù)氧+SN50組（H/R+SN50組）為1.21±0.05。其余各組與對(duì)照組相比，p＜0.01;衣霉素+SN50組與衣霉素相比，p＜0.05;缺氧/復(fù)氧+SN50組與缺氧/復(fù)氧組相比，p＜0.01。CCK-8研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺氧/復(fù)氧后存在心肌損害，SN50使用后心肌損害減輕。在空白對(duì)照組（Control組）心率（HR，次/分）為125.3±2.5，衣霉素組（Tm組）為32.7±2.5，缺氧/復(fù)氧組（H/R組）

20、58.7±5.5，衣霉素+SN50組（Tm+SN50組）為65.7±10.0，缺氧/復(fù)氧+SN50組（H/R+SN50組）為97.3±1.2。其余各組與對(duì)照組相比，p＜0.01;衣霉素+SN50組與衣霉素相比，p＜0.01;缺氧/復(fù)氧+SN50組與缺氧/復(fù)氧組相比，p＜0.01。
　　病理研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺氧/復(fù)氧后存在心肌損害，SN50使用后可減輕心肌損害。在空白對(duì)照組（Control組）病理?yè)p傷評(píng)分為3.67±0.58，衣霉素組

21、（Tm組）為1.67±0.58，缺氧/復(fù)氧組為（H/R組）1.33±0.58，衣霉素+SN50組（Tm+SN50組）為3.33±0.58，缺氧/復(fù)氧+SN50組（H/R+SN50組）為1.66±0.58。其余各組與對(duì)照組相比，p＜0.01;衣霉素+SN50組與衣霉素相比，p＜0.05;缺氧/復(fù)氧+SN50組與缺氧/復(fù)氧組相比，p＜0.01。
　　結(jié)論:
　　心肌缺氧/復(fù)氧后，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-炎癥反應(yīng)，在此過(guò)程中NF-κb起著