內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理提高腎組織對(duì)缺血再灌注損傷耐受性的作用及機(jī)制.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種常見臨床綜合征，也是危重癥患者常見合并癥，若AKI發(fā)展至重癥急性腎衰竭(acute renal failure，ARF)，死亡率可高達(dá)50％，并且10％-14％的急性腎衰竭患者因腎功能不能恢復(fù)而需要終身腎臟替代治療。缺血再灌注損傷是引起急性腎衰竭的主要原因之一，常發(fā)生于腎移植、心肺旁路手術(shù)后、創(chuàng)傷、失血性休克以及膿毒血癥等疾病背景下。目前的救治措施除了腎臟替代，尚無(wú)其它有

2、效方法。因此闡明缺血性AKI發(fā)生機(jī)制，探索有效預(yù)防和治療措施對(duì)降低AKI發(fā)生率和死亡率具有重要科學(xué)意義。
　　 細(xì)胞對(duì)缺血缺氧、氧應(yīng)激以及炎癥介質(zhì)等損害因素的應(yīng)答本質(zhì)上是一種應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞應(yīng)激是細(xì)胞功能失常甚至死亡的重要原因。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的細(xì)胞器，擔(dān)負(fù)極為重要的生理功能，包括轉(zhuǎn)錄后修飾、折疊、新合成的分泌蛋白和膜蛋白的組裝等，正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能是細(xì)胞存活并實(shí)施生理功能最基本的條件。已證實(shí)，細(xì)胞一旦因缺氧、低糖以及能量匱乏等因

3、素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白聚集、蛋白超載、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)機(jī)制就會(huì)被啟動(dòng)。適宜的ERS通過(guò)PERK(PKR-like ER kinase)/eIf2(eukaryotic translation initiation factor2)、IRE1α(inositol requiring kinase1)/XBP1(X-box binding protein-1)

4、和ATF6(mRNAencoding transcription factors)信號(hào)途徑，減緩基因轉(zhuǎn)錄抑制新蛋白合成；上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白如糖調(diào)節(jié)蛋白-78(Glucose-regulated protein78，GRP-78)和熱休克蛋白-70等分子的表達(dá)以幫助蛋白正確折疊、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)使細(xì)胞免受各種應(yīng)激的損害作用。當(dāng)ERS過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)不能重新建立，則通過(guò)激活下游損害效應(yīng)途徑包括ATF4/CHOP

5、(又稱生長(zhǎng)停滯及DNA損傷基因153，growtharrest and DNA damage inducible gene153，GADD153)、ATF6/CHOP、Caspase-12和Ask1/JNK通路引起細(xì)胞凋亡。此外，過(guò)度ERS還可以激活NF-κ B和炎性caspase(infalmmatary caspase)信號(hào)途徑引起非感染性炎癥反應(yīng)。已證實(shí)，過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是急性缺血性心臟和腦組織損傷的重要機(jī)制。在腎臟，缺血再灌注通過(guò)

6、上調(diào)ATF4/CHOP途徑引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，ERS是細(xì)胞對(duì)有害刺激的應(yīng)答機(jī)制中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，調(diào)控保護(hù)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子和過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效應(yīng)分子表達(dá)，是增強(qiáng)組織損傷耐受性的重要途徑。已有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)劑預(yù)處理可通過(guò)上調(diào)腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子如糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein78，GRP78)，熱休克蛋白等伴侶分子表達(dá)，顯著減輕腎組織缺血再灌注損傷，說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理可以上調(diào)內(nèi)

7、質(zhì)網(wǎng)伴侶分子發(fā)揮腎保護(hù)作用。那么內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預(yù)處理是否還可通過(guò)抑制過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑保護(hù)腎組織免受缺血再灌注損傷?
　　 腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)是急性缺血性腎損傷的重要病理生理基礎(chǔ)。已證實(shí)，急性缺血再灌注啟動(dòng)過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是腎小管上皮細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性缺血性腎損傷炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制目前尚不十分清楚。IL-1β是炎癥反應(yīng)早期產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，具有放大炎癥反應(yīng)瀑布的重要生物學(xué)作用，在急性缺血性腎損傷的發(fā)生發(fā)

8、展中扮演了重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素肺損傷、急性胰腺炎以及結(jié)腸炎等疾病狀態(tài)下，過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)上調(diào)CHOP表達(dá)激活炎癥caspase途徑，活化IL-1β轉(zhuǎn)化酶(caspase-1)，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β前體活化為成熟IL-1β。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血再灌注可上調(diào)腎組織CHOP表達(dá)和IL-1β水平，而抑制CHOP表達(dá)可以減少IL-1β產(chǎn)生，說(shuō)明CHOP表達(dá)增加可能是急性缺血性腎損傷炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制。本課題進(jìn)一步研究急性缺血再灌注后

9、腎組織CHOP、炎性caspase表達(dá)以及IL-1β變化的規(guī)律，并觀察衣霉素預(yù)處理對(duì)CHOP以及腎組織炎癥反應(yīng)的影響，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理防治急性缺血性腎損傷提供科學(xué)依據(jù)。
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、急性缺血再灌注對(duì)腎組織CHOP及其下游效應(yīng)分子表達(dá)的影響
　　 采用雙腎蒂夾閉缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷模型。用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂40min后放開雙側(cè)動(dòng)脈夾再灌注，以

10、保溫毯保持體溫。分別在1、6、12、24 h后取標(biāo)本檢測(cè)血Cr、BUN水平。PAS染色檢測(cè)腎組織病理改變，分別以免疫組化和Western blot方法檢測(cè)腎組織GRP78、CHOP、caspase11、caspase1、IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　 2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理提高腎組織對(duì)缺血再灌注損傷耐受性的作用及機(jī)制
　　 采用雙腎蒂夾閉缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷模型，雙側(cè)腎蒂40mi

11、n后放開雙側(cè)動(dòng)脈夾再灌注12h。大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組，I/R12h組，TM組，TM+I/R12h組，DMSO+I/R12h組。對(duì)照組只開腹，不夾閉腎蒂。TM預(yù)處理組于手術(shù)前24h腹腔內(nèi)給藥(0.6mg/kg)。DMSO+I/R12h組于手術(shù)前24h給予等劑量DMSO(1ml2％DMSO，不含TM)。取標(biāo)本后檢測(cè)血Cr、BUN水平。腎組織PAS染色評(píng)估腎組織損傷，Western blot方法檢測(cè)腎組織GRP78、CHOP、Caspas

12、e11、Caspase1、IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)。免疫組化檢測(cè)腎組織GRP78、CHOP表達(dá)。
　　 二、結(jié)果：
　　 1、急性缺血再灌注后腎組織CHOP、炎性caspase表達(dá)以及IL-1β的變化規(guī)律
　　 1.1腎功能變化及腎組織病理改變
　　 腎功能變化：與對(duì)照組比較，血清肌酐 I/R1h時(shí)無(wú)明顯變化，I/R6h開始升高，12h達(dá)到峰值，24h下降。
　　 病理變化：I/R1 h，皮髓交界處腎

13、小管上皮細(xì)胞濁腫，空泡樣變，偶見腎小管上皮細(xì)胞脫落；I/R6h，可見部分腎小管上皮細(xì)胞脫落、形成細(xì)胞管型；I/R12h病變最為嚴(yán)重，腎小管上皮細(xì)胞廣泛壞死脫落形成大量細(xì)胞管型，基底膜裸露，部分腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫和單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)；I/R24h腎小管管腔中仍可壞死脫落的上皮細(xì)胞，但管型減少，腎間質(zhì)水腫減輕。
　　 1.2急性缺血再灌注對(duì)腎組織CHOP、炎性caspase表達(dá)以及IL-1β影響
　　 GRP78表達(dá)變化：I

14、/R后1h開始升高，12h達(dá)到峰值，24h開始下降，但仍高于對(duì)照組水平。
　　 CHOP表達(dá)變化：對(duì)照組CHOP有基礎(chǔ)水平表達(dá)，I/R1h時(shí)開始增加，I/R6h時(shí)顯著增多，I/R12h達(dá)峰值，I/R24h開始下降。
　　 Caspase-11表達(dá)變化：對(duì)照組caspase-11前體有基礎(chǔ)水平表達(dá)，I/R1h時(shí)無(wú)明顯增加，I/R6h時(shí)顯著增多，I/R12h達(dá)峰值，I/R24h開始減少；活性caspase-11在I/R6h時(shí)

15、開始增加，I/R12h達(dá)峰值，I/R24h開始減少。
　　 Caspase-1表達(dá)變化：對(duì)照組caspase-1前體有基礎(chǔ)水平表達(dá)，I/R1h時(shí)表達(dá)開始增加，I/R6h時(shí)顯著增多，l/R24h開始減少；活性caspase-1在I/R1h時(shí)開始增加，I/R12h達(dá)峰值，I/R24h開始減少。
　　 IL-1β表達(dá)變化：對(duì)照組IL-1β前體有基礎(chǔ)水平表達(dá)，I/R1h時(shí)與對(duì)照組比較無(wú)明顯增加，I/R6h時(shí)顯著增多，I/R24h

16、開始減少；成熟IL-1β在I/R1h時(shí)即開始增加，I/R12h達(dá)峰值，I/R24h開始減少。
　　 2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理提高腎組織對(duì)缺血再灌注損傷耐受性的作用及機(jī)制
　　 2.1衣霉素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠腎損傷的保護(hù)作用
　　 低劑量衣霉素組血清肌酐水平與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，光鏡下也未見明顯腎組織病理改變，說(shuō)明低劑量衣霉素對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)和功能無(wú)明顯影響。衣霉素預(yù)處理組血清肌酐水平顯著低于I/R12h組，腎組織病

17、理改變顯著減輕，說(shuō)明衣霉素預(yù)處理可顯著提高腎組織對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性。
　　 2.2衣霉素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注腎組織CHOP、炎性caspase以及IL-1β的影響
　　 GRP78表達(dá)變化：與對(duì)照組比較，低劑量衣霉素可誘導(dǎo)腎組織GRP78表達(dá)，I/R12h后腎組織GRP78表達(dá)增加更為顯著，衣霉素預(yù)處理組的缺血再灌注腎組織GRP78表達(dá)增加顯著高于I/R12h組。
　　 CHOP表達(dá)變化：與對(duì)照組比較，低劑量

18、衣霉素對(duì)腎組織CHOP表達(dá)無(wú)明顯影響；I/R12h后腎組織CHOP表達(dá)顯著增加；衣霉素預(yù)處理可使缺血再灌注腎組織CHOP表達(dá)顯著減少。
　　 Caspase-11、1、IL-1β表達(dá)變化：與對(duì)照組比較，低劑量衣霉素對(duì)Caspase-11、1、IL-1β表達(dá)和活化均無(wú)明顯影響；I/R12h后腎組織Caspase-11、1、IL-1β表達(dá)和活化顯著增加；衣霉素預(yù)處理可以顯著抑制缺血再灌注腎組織Caspase-11、1、IL-1β表達(dá)

19、和活化。
　　 三、結(jié)論：
　　 1、急性缺血再灌注可引起腎組織過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CHOP表達(dá)上調(diào)。CHOP表達(dá)增加先于caspase-11和caspase-1表達(dá)變化，caspase-1的活化與成熟IL-1β水平的變化一致，提示缺血再灌注可啟動(dòng)過(guò)度ERS，CHOP可能通過(guò)調(diào)控炎性caspase途徑促進(jìn)腎組織IL-1β的產(chǎn)生，這可能是急性缺血性腎損傷炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制。
　　 2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理能顯著上調(diào)I/R后