低氧應(yīng)答對妊娠期高血壓疾病病理胎盤形成的影響.pdf

1、研究背景：
　　妊娠期高血壓疾病(hypertensivedisordercomplicatingpregnancy)是以高血壓、水腫和蛋白尿為特征的產(chǎn)科常見并發(fā)癥，是孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因。由于其發(fā)病機理尚未完全闡明，所以就給該病的防治帶來了一定困難。
　　從胚胎植入到胎兒分娩，成功的妊娠依賴于正常的胎盤功能。滋養(yǎng)層細胞對子宮內(nèi)膜侵入過淺，子宮螺旋動脈重塑障礙是妊娠期高血壓疾病胎盤的病理特點。滋養(yǎng)層細胞淺植入，子宮螺

2、旋動脈重塑不全，胎盤供血受影響，缺血缺氧，致使滋養(yǎng)層細胞釋放一系列的毒性因子進入母體血液循環(huán)，引起廣泛的血管內(nèi)皮細胞損傷，最終導(dǎo)致妊娠期高血壓疾病的發(fā)生[1]。
　　目前國內(nèi)外已有大量研究證明妊娠早期氧分壓變化與滋養(yǎng)細胞侵入能力的變化密切相關(guān)。在胎盤形成過程中，滋養(yǎng)層細胞的侵潤能力決定妊娠的結(jié)局，而滋養(yǎng)層細胞的侵潤能力則與胎盤局部氧含量密切相關(guān)，長時間的缺氧環(huán)境使滋養(yǎng)細胞的增殖活動增強，但是卻影響滋養(yǎng)細胞對子宮內(nèi)膜的侵入。因此，在

3、妊娠期高血壓疾病的發(fā)病過稱中低氧應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。
　　缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainduciblefactor1，HIF-1）是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮特異活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。它屬于缺氧反應(yīng)基因的中介因子，可以傳導(dǎo)缺氧信號，激活一些與缺氧相關(guān)聯(lián)的基因，如胰島素樣生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶類、內(nèi)皮素類、生長轉(zhuǎn)化因子、一氧化氮合酶等，參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞增值分化，影響子宮螺旋動脈的新生或重塑，使細胞能夠適應(yīng)低濃度氧環(huán)境。

4、同樣，若其表達異常也可引起多種病理變化。其下游調(diào)控因子ET-1是迄今為止我們發(fā)現(xiàn)的影響血管收縮能力最強的生物物質(zhì)，它具有廣泛的生物學(xué)活性，,對于平滑肌收縮、鈣離子運轉(zhuǎn)、神經(jīng)信號傳導(dǎo)、多種細胞的凋亡等方面都具有調(diào)節(jié)功能。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的重要成員之一,與某些生理功能(如胚胎的植入、組織發(fā)生、傷口愈合等)和病理過程(腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移)密切相關(guān)

5、。胚胎侵入母體需要黏附、降解、穿越ECM間隙而完成。MMP-9直接作用于血管腔面附著物、蛻膜間質(zhì)及基底膜，發(fā)揮著酶降解功能,為滋養(yǎng)細胞浸潤子宮內(nèi)膜清除了障礙,是滋養(yǎng)細胞浸入活動的限速步驟,也是經(jīng)過大量體內(nèi)外實驗得到公認的機制[2]。但MMP-9的表達是否與孕早期胎盤形成時低氧應(yīng)答過程中HIF-1α表達異常有關(guān)，兩者是否存在相關(guān)性目前鮮有報道給予說明。
　　本實驗旨在通過研究氧調(diào)節(jié)因子HIF-1α與其下游調(diào)控因子ET-1及MMP-9

6、的相互關(guān)系，探討低氧應(yīng)答異常對于妊娠期高血壓疾病胎盤植入及子宮螺旋動脈重塑的影響，為妊娠期高血壓疾病的病因病機研究提供新的思路和證據(jù)。
　　實驗?zāi)康募耙饬x：
　　1.通過臨床標本收集檢測氧調(diào)節(jié)因子HIF-1α與其下游調(diào)控因子ET-1在子癇前期患者及正常妊娠患者胎盤中的表達，說明兩者的相關(guān)性，為HIF-1α及ET-1在妊娠期高血壓疾病發(fā)病過稱中的作用提供理論依據(jù)。
　　2.通過分離培養(yǎng)早孕期絨毛滋養(yǎng)細胞，探索絨毛組織滋養(yǎng)

7、層細胞簡單有效的培養(yǎng)方法，為體外研究滋養(yǎng)細胞疾病提供有效的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　3.通過檢測不同氧濃度下體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞HIF-1α和MMP-9的表達量，說明妊娠早期母胎界面氧濃度變化對胎盤發(fā)育的影響，揭示在胎盤形成過程中HIF-1α與MMP-9的相互關(guān)系，為妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機制提供新的思路。
　　研究方法：
　　1.臨床收集子癇前期患者胎盤組織30例（其中輕度12例，重度18例）及正常妊娠孕婦的胎盤組織20例，采用

8、SP免疫組化法檢測各組胎盤組織中HIF-1α及ET-1的蛋白表達部位及表達量；Western-blotting法檢測各組胎盤組織中HIF-1α及ET-1蛋白表達量。
　　2.采用組織貼塊培養(yǎng)法對早孕期無菌絨毛組織進行原代培養(yǎng)。絨毛反復(fù)漂洗去除血塊，眼科剪清除脫膜組織后，分離絨毛組織，剪碎；糊狀組織碎片以間距5mm均勻鋪于濕潤的培養(yǎng)瓶底部，用適量含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；隔日換液，2周后消化傳代。利用消化培養(yǎng)法及差速

9、貼壁法對滋養(yǎng)細胞進行分離純化。角蛋白及其波形蛋白檢測細胞純度。
　　3.利用化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑CoCl2誘導(dǎo)不同氧濃度環(huán)境，將體外分離培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞分為低氧組1（100μl/L24h）、低氧組2（50μl/L24h）、復(fù)氧組（50μl/L6h～18h）、常氧組（24h）進行培養(yǎng)，Trizol法分別收集各組細胞提取總RNA，運用半定量PCR技術(shù)檢測各誘導(dǎo)組細胞中HIF-1α與MMP-9mRNA的表達量。
　　研究結(jié)果：
　　

10、1.子癇前期組與正常組比較，HIF-1α表達明顯增高,差異有顯著性(t=-5.710，P<0.05),重度子癇前期HIF-1α的表達明顯高于輕度子癇前期,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-6.945，P<0.05)。同樣，子癇前期組與正常組比較,ET-1表達明顯增強,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.659，P<0.05),重度子癇前期ET-1的表達明顯高于輕度子癇前期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.966，P<0.05)。子癇前期組胎盤組織中HI

11、F-1α和ET-1的相關(guān)性分析顯示兩者呈正相關(guān)(γ=0.659，P<0.05)，隨著缺氧程度的加深，絨毛組織中HIF-1α與MMP-9的表達量呈負相關(guān)性。
　　2.組織塊兒貼壁24小時后細胞開始向組織周邊貼壁擴散生長，一周后細胞數(shù)量明顯增多，多呈多邊不規(guī)則形狀或長梭形。兩周后組織團塊邊界明顯模糊與周邊細胞融合，部分細胞團間連接平鋪呈片狀生長,三周鋪滿60％培養(yǎng)瓶底部。經(jīng)多次反復(fù)貼壁法及消化排除法傳代后，細胞多呈上皮細胞樣片狀平鋪生

12、長，多角不規(guī)則形態(tài)，形態(tài)基本一致，個別呈纖維樣細胞。核大呈圓形，近于細胞中央，胞質(zhì)豐富。經(jīng)免疫組化化學(xué)染色，CK7陽性表達率呈75％以上，波形蛋白陽性表達率低于10％，說明滋養(yǎng)細胞的純度在75％以上。
　　3.低氧1組HIF-1αmRNA的表達最明顯，隨著CoCl2濃度的降低，細胞生長環(huán)境的氧濃度增高，HIF-1αmRNA的表達呈明顯降低趨勢）；同時，MMP-9mRNA在常氧組的表達最明顯，隨著CoCl2濃度的增高，細胞生長環(huán)境的

13、氧濃度降低，MMP-9mRNA的表達呈明顯降低趨勢，兩者呈負性相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.HIF-1α在患病組胎盤的表達明顯高于正常妊娠孕婦組，并且與血管收縮性密切相關(guān)的ET-1呈正相關(guān)，HIF-1α的異常表達可以引起下游靶基因的異常轉(zhuǎn)錄，影響胎盤的發(fā)育。HIF-1的降解和轉(zhuǎn)錄與妊高癥的產(chǎn)生具有相關(guān)性。
　　2.妊娠期高血壓疾病的發(fā)生很可能是由于HIF-1調(diào)節(jié)異常，影響了與滋養(yǎng)細胞侵入密切相關(guān)的MMP-9的表達，導(dǎo)致滋