PMK-2信號途徑介導(dǎo)秀麗小桿線蟲對蘇云金芽胞桿菌Cry6A晶體蛋白防御反應(yīng)的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白具有很好的殺蟲效果，并且作為生物農(nóng)藥得到了廣泛的應(yīng)用。目前報道的對線蟲具有活性的Bt晶體蛋白有很多，最典型的有Cry5B和Cry6A兩大類。Cry6A是一種結(jié)構(gòu)非常獨(dú)特的殺蟲伴胞晶體蛋白，它與Cry5B及其他的伴胞晶體蛋白在結(jié)構(gòu)上有很大的差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。并且Cry6A沒有Cry5亞家族中的三個保守結(jié)構(gòu)域。已有研究初步證明Cry5B與Cry6A具有不

2、同的殺蟲機(jī)制。因此，Cry6A在解決昆蟲對晶體蛋白的抗性問題方面具有很大的優(yōu)勢，是一種非常具有應(yīng)用前景的殺蟲晶體蛋白。
　　本研究以模式生物秀麗小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）為材料，探索線蟲通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對Cry6A晶體蛋白毒素的防御反應(yīng)。秀麗小桿線蟲體內(nèi)存在3個p38 MAPK異構(gòu)體PMK-1、PMK-2、PMK-3，pmk-1、pmk-2、pmk-3、這三個基因位于線蟲IV號染色體上，組成一個操縱子

3、，共用一個啟動子。并且PMK-1和PMK-2氨基酸序列的同源性高達(dá)62％。在秀麗小桿線蟲腸細(xì)胞中PMK-1調(diào)控先天免疫，能被TIR-1-NSY-1-SEK-1信號通路所激活，而PMK-2由于受miR-58家族的干擾，在腸細(xì)胞中的表達(dá)被高度抑制，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。盡管PMK-1、PMK-2具有高度的同源性，但兩者可能是功能截然不同的蛋白。我們的前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Cry6A毒素蛋白能夠使秀麗小桿線蟲體內(nèi)的PMK-2蛋白表達(dá)水平

4、顯著上調(diào)，因此我們推測PMK-2可能參與了秀麗小桿線蟲對Cry6A晶體蛋白的防御反應(yīng)。
　　PMK-1能被上游激酶NSY-1（一種MAPKK）和SEK-1(一種MAPKK)所激活，而pmk-1和pmk-2位于同一個操縱子上，因此我們推測PMK-2也能被NSY-1和SEK-1所激活。
　　我們的實(shí)驗(yàn)表明:1、Cry6A晶體蛋白毒素作用秀麗小桿線蟲能顯著提高pmk-2基因轉(zhuǎn)錄水平;2、通過RNAi技術(shù)沉默秀麗小桿線蟲pmk-2基

5、因，線蟲對Cry6A晶體蛋白毒素敏感性顯著增強(qiáng);3、通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測證明Cry6A晶體蛋白毒素能誘導(dǎo)線蟲體內(nèi)PMK-1和PMK-2發(fā)生磷酸化，從而激活PMK信號途徑。4、檢測PMK上游兩個激酶NSY-1和SEK-1突變體對Cry6A毒素敏感性發(fā)現(xiàn)，相對于野生型線蟲突變體對Cry6A的敏感性顯著增強(qiáng)，且Cry6A毒素不能誘導(dǎo)兩個突變體中PMK-2發(fā)生磷酸化。此結(jié)果表明，PMK-2與PMK-1一樣，是通過上游NSY-1和