核心結(jié)合因子αl(Cbfα1)在高磷誘導(dǎo)VSMC鈣化中信號通路的研究.pdf

1、目的：本文旨在探討核心結(jié)合因子αl（Cbfα1）在高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）鈣化中可能的信號通路，觀察絲/蘇氨酸蛋白激(Akt)在VSMC鈣化中的表達(dá)情況及其與Cbfα1表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，試圖闡明AKt在高磷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用。
　　方法：1.體外原代培養(yǎng)SD大鼠VSMC,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。α-SMA免疫組化鑒定細(xì)胞；3-5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組：（1）正常磷組

2、（1.3mmol/L）；(2)高磷組(2.6mmol/L)，干預(yù)7天后，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及茜素紅染色檢測細(xì)胞鈣鹽沉積情況；Real-time PCR檢測Cbfα1、骨橋蛋白（OPN）mRNA表達(dá)情況；Western Blot技術(shù)檢測p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN蛋白表達(dá)情況。
　　3．檢測到高磷組AKt活化表達(dá)后，給與AKt抑制劑Wortmannin干預(yù)。VSMC分為：（1）高磷組（2.6mmol/L）；（2）高

3、磷+Wortmannin(5nmol/L)；（3）高磷+Wortmannin（10nmol/L）（4）高磷+ Wortmannin（30nmol/L）；（5）高磷+ Wortmannin（50nmol/L）；(6)高磷+ Wortmannin（100nmol/L），干預(yù)24h后，Real-time PCR檢測Cbfα1、骨橋蛋白（OPN）mRNA表達(dá)情況; Western Blot檢測p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN蛋白表

4、達(dá)情況。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　結(jié)果：1.細(xì)胞鑒定：倒置相差顯微鏡觀察，大鼠VSMC呈梭行，典型“峰-谷”樣生長；抗α-SMA免疫組織化學(xué)顯示，VSMC胞漿呈現(xiàn)大量棕色顆粒。
　　2．干預(yù)7天后，茜素紅染色顯示，正常磷組無鈣鹽沉積，而高磷組鈣鹽沉積明顯；Real-time PCR顯示,與正常磷組相比，高磷組Cbfα1、OPN mRNA表達(dá)增高（P<0.05）；Western Blot顯示，與正常磷組相比，高磷組p-AKt(s

5、er473)、Cbfα1、OPN蛋白表達(dá)增高（P<0.05）。
　　3.給與Wortmannin干預(yù)24h后，茜素紅染色結(jié)果，與高磷組相比，高磷+Wortmannin（5nmol/L）和（10nmol/L）組鈣鹽沉積無明顯減輕，高磷+Wortmannin（30nmol/L）一定程度減輕，而高磷+ Wortmannin（50nmol/L）和（100nmol/L）組明顯減輕；Real-time PCR顯示，相對于高磷組，高磷+Wort

6、mannin（5nmol/L）和（10nmol/L）組Cbfα1、OPN mRNA表達(dá)無明顯差異（P>0.05）,高磷+ Wortmannin（30nmol/L）組表達(dá)量一定程度減弱（P<0.05）,高磷+ Wortmannin（50nmol/L）和（100nmol/L）組表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。Western Blot顯示，與高磷組比較，高磷+ Wortmannin（5nmol/L）與（10nmol/L）組 p-AKt(ser4

7、73)、Cbfα1、OPN蛋白表達(dá)變化不明顯（P>0.05），高磷+Wortmannin（30nmol/L）組表達(dá)相對減弱（P<0.05）,高磷+ Wortmannin（50nmol/L）與（100nmol/L）組表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.高磷可體外誘導(dǎo)大鼠VSMC鈣化，Cbfα1、OPN mRNA表達(dá)增高；p-AKt(ser473)、Cbfα1和OPN蛋白表達(dá)增高。
　　2.Wortmannin可明顯抑