補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)模擬微重力成骨細(xì)胞的影響.pdf

1、失重即微重力，是物體只表現(xiàn)為質(zhì)量而不表現(xiàn)為重量的特殊力學(xué)環(huán)境（10-6～10-9g）。在失重飛行引起的一系列人體生理系統(tǒng)變化中，其他生理系統(tǒng)的變化在航天飛行中會(huì)達(dá)到一種新的平衡狀態(tài)，返回地面后，經(jīng)過一段時(shí)間可以很快恢復(fù)。但骨鈣的丟失卻持續(xù)發(fā)展，引起失重性骨質(zhì)疏松。骨代謝的調(diào)節(jié)失衡是影響宇航員健康的主要問題。已證實(shí)失重性骨質(zhì)疏松的骨丟失主要是由于骨形成的減少而不是骨吸收的增加。目前航天中采用的各種對(duì)抗措施均未能起到理想的效果，因此預(yù)防失重

2、性骨丟失的研究已成為國(guó)內(nèi)外航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)課題。 我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，博大精深，已證實(shí)對(duì)原發(fā)骨質(zhì)疏松癥有較好的療效及較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)腎療法是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥的重要方法，其理論基礎(chǔ)源于中醫(yī)“腎主骨生髓”學(xué)說。《醫(yī)經(jīng)精義》日：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所以合也，髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強(qiáng)?！毖a(bǔ)腎壯骨中藥主要由淫羊藿、生地黃、補(bǔ)骨脂、川續(xù)斷等組成。我們將中醫(yī)藥理論運(yùn)用于航天醫(yī)學(xué)研究，在前期的整體實(shí)驗(yàn)中

3、我們已經(jīng)從骨密度、骨生物力學(xué)、骨組織形態(tài)學(xué)、骨生化學(xué)各角度對(duì)補(bǔ)腎壯骨中藥進(jìn)行了深入研究，證明其對(duì)尾吊模擬失重大鼠骨丟失有明顯的改善作用。但其在細(xì)胞學(xué)上改變尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)選擇中藥復(fù)方仙靈骨葆膠囊制備含藥血清。復(fù)方仙靈骨葆膠囊是富含植物雌激素的草藥制劑，分別含有金雀異黃酮510μg/g、大豆黃素2500μg/g、淫羊藿9200μg/g、補(bǔ)骨脂素930μg/g和異補(bǔ)骨脂素950μg/g，是具有代表性的方劑之一。本實(shí)驗(yàn)在研究補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)失

4、重骨代謝影響整體實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察了該方對(duì)體外模擬失重培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的影響，擬揭示該方對(duì)抗骨丟失的細(xì)胞學(xué)改變。 目的: 本研究主要從細(xì)胞學(xué)層面上探討補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)模擬失重條件下體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響，擬在細(xì)胞水平上揭示該方對(duì)抗骨丟失的機(jī)制，以期為失重性骨質(zhì)疏松的臨床治療研究提供新的線索。 對(duì)象和方法: 1.成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增：取新生1d SD大鼠乳鼠，無菌條件下取顱頂骨，去除周圍組織；DMEM培養(yǎng)

5、基漂洗后將其剪碎成小于0.5mm3的碎片，經(jīng)0.25%胰蛋白酶預(yù)消化15～20min，間斷振蕩，棄上清；加入0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶混合液，37℃5%CO2恒溫孵育箱內(nèi)消化30min，間斷振蕩，取上清液1，000rpm離心5min，收集細(xì)胞接種于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第3d首次換液，第6d首次傳代。以后每3d換液一次，5d傳代一次。臺(tái)盼藍(lán)染色記數(shù)檢測(cè)原代細(xì)胞懸液活細(xì)胞率。依據(jù)貼

6、壁培養(yǎng)法分離和擴(kuò)增成骨細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，取前6代細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)象。 2.成骨細(xì)胞功能鑒定：采用改良Gomori鈣鈷法堿性磷酸酶（ALP）染色觀察，Von Kossa's礦化結(jié)節(jié)染色法檢測(cè)體外礦化能力。 3.復(fù)方中藥含藥血清制備：取健康雄性SD大鼠共28只，隨機(jī)分為2組。用藥組18只，均灌胃給藥（復(fù)方仙靈骨葆膠囊）一日2次連續(xù)5次，于末次給藥后1～2小時(shí)，乙醚麻醉無菌條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，冷置1h后離心分離血清，經(jīng)5

7、6℃30min滅活，0.22μm濾膜抽濾除菌，是為含藥血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。正常?duì)照組和模擬失重組，各5只，按相同程序灌等體積水，所取血清是為正常血清，作為對(duì)照用。大鼠灌胃給藥劑量均按人日用臨床劑量，經(jīng)人一大鼠體表面積比值折算成相當(dāng)于臨床劑量，以4倍量給藥。 4.建立模擬微重力成骨細(xì)胞模型、分組干預(yù)：實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，失重模型組和含藥血清不同濃度組，將微載體0.5g和1×107個(gè)成骨細(xì)胞加入旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器中，添加含10

8、%FBS和5%對(duì)照血清（或含藥血清，終濃度分別為5%、10%、20%）的DMEM培養(yǎng)基至50ml，排空氣泡。調(diào)整轉(zhuǎn)速使細(xì)胞與微載體的黏附物能隨反應(yīng)器內(nèi)外筒一起以較為理想的運(yùn)行軌跡與轉(zhuǎn)筒一起運(yùn)動(dòng)后，逐漸加大轉(zhuǎn)速直至30rpm（相當(dāng)于10-3G的微重力狀態(tài)）。置于37℃5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)72h。 5.ALP、BGP活性測(cè)定：對(duì)硝基苯酚法測(cè)定含藥血清作用72h后培養(yǎng)液中ALP活性，放射免疫測(cè)定法測(cè)定BGP活性。 6.成

9、骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)：細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)72h后，胰蛋白酶常規(guī)消化，制成細(xì)胞懸液，PBS洗滌幾次，將細(xì)胞重懸于200μL的Binding Buffer，加入10μLannexin V-FITC和5μL PI，混勻，避光室溫反應(yīng)15min，加入300μL BindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin-V陽性細(xì)胞。 結(jié)果: 1.成骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況：經(jīng)“兩步消化-組織塊培養(yǎng)法”提取的成骨細(xì)胞，在相差顯微鏡下呈三角形、菱形、多邊

10、形等不規(guī)則形狀，透明度好。細(xì)胞有觸突，胞漿豐富并向外伸展，伸出幾個(gè)突起與臨近細(xì)胞伸出的突起相連，有聚集成團(tuán)（集落）的現(xiàn)象。胞核大而清楚，呈圓形或卵圓形，含1～2個(gè)核仁。組織塊培養(yǎng)法第3天，倒置顯微鏡下可見大量成骨細(xì)胞從組織塊周邊爬出，培養(yǎng)第5天，移出的細(xì)胞明顯增加，以骨塊為中心，向周圍呈放射生長(zhǎng)，間雜成纖維細(xì)胞后期用差異貼壁法分離純化。7天后細(xì)胞基本鋪滿單層；組織塊培養(yǎng)法需10天細(xì)胞鋪滿單層。長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，細(xì)胞為梭形及立方塊狀，排列緊密，

11、可見圓形或鱗片形細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨細(xì)胞可呈多層生長(zhǎng)。 2.細(xì)胞活力測(cè)定：臺(tái)盼藍(lán)染色后，藍(lán)染細(xì)胞為死亡細(xì)胞。按未被藍(lán)染細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為初步得到細(xì)胞活力的數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)活細(xì)胞率95%～99%。 3.成骨細(xì)胞的鑒定 （1）ALP活性染色：細(xì)胞鈣鈷法染色顯示呈強(qiáng)陽性，細(xì)胞胞漿內(nèi)可見灰、黑顆粒定位于酶活性之處，證明細(xì)胞內(nèi)有活性ALP的表達(dá)。 （2）體外礦化能力檢測(cè)：末次傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)至3、4周

12、后細(xì)胞呈復(fù)層狀生長(zhǎng)，中心部細(xì)胞密集可發(fā)生鈣化，形成肉眼可見的散在白色點(diǎn)狀物。Von Kossa's法礦化結(jié)節(jié)染色后，鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色，背景紅色。 4.在體外模擬失重條件下，失重模型組與對(duì)照組相比，成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP、BGP活性均有顯著降低（t=17.033，P=0.000；t=7.886，P=0.001），表明已建立了模擬失重成骨細(xì)胞模型。與對(duì)照組相比，失重模型組成骨細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=11.214，P=0.000），

13、說明失重可引起成骨細(xì)胞凋亡增加。 5.中藥復(fù)方對(duì)體外模擬失重條件下成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP活性的影響：模擬失重條件下，各培養(yǎng)組間ALP活性有顯著性差異（F=82.053，P=0.000）。較之失重模型組，含藥血清不同濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALP活性均有不同程度升高，其中該方含藥血清10%和20%濃度組ALP活性升高顯著（P=0.000，P=0.000）。含藥血清5%，10%和20%濃度組間兩兩比較均有顯著性差異（P=0.000，P=

14、0.000，P=0.020）0。 6.中藥復(fù)方對(duì)體外模擬失重條件下成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中BGP的影響：模擬失重條件下，各培養(yǎng)組間BGP活性有顯著性差異（F=18.907，P=0.001）。與失重模型組比較，含藥血清不同濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中的BGP活性均有不同程度升高，其中該方含藥血清20%濃度組BGP活性顯著升高（P=0.001）。含藥血清10%和20%濃度組間比較有顯著性差異（P=0.015），兩者與5%濃度組比較BGP活性均無明顯變

15、化（P=1.000，P=1.003）。 7.中藥復(fù)方對(duì)體外模擬失重條件下成骨細(xì)胞凋亡的抑制作用：模擬失重條件下，各培養(yǎng)組間成骨細(xì)胞細(xì)胞凋亡率有顯著性差異（F=23.971，P=0.000）。與失重模型組比較，含藥血清不同濃度組成骨細(xì)胞凋亡率均有不同程度降低，其中該方含藥血清10%和20%濃度組成骨細(xì)胞凋亡率顯著降低（P=0.002，P=0.000）。含藥血清5%和20%濃度組間比較有顯著性差異（P=0.007），兩者與10%濃度