疏風(fēng)宣肺等方法防治大鼠慢性血清病性腎炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性腎小球腎炎(CGN)，是由多種病因引起的原發(fā)于腎小球的一組臨床表現(xiàn)相似，而病理改變不一，預(yù)后不盡相同的免疫性疾病。其共同的臨床特點(diǎn)是病程較長(zhǎng)，呈緩慢進(jìn)展并伴有不同程度的蛋白尿、血尿、高血壓、水腫及(或)氮質(zhì)血癥，腎功能損害呈進(jìn)行性加重。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)引起終末期慢性腎衰的多種病因中，CGN居首位，約占64.1％。 目的：慢性腎炎的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，但越來(lái)越多的研究成果豐富并發(fā)展了對(duì)CGN發(fā)病機(jī)理的闡釋。其中，核轉(zhuǎn)錄

2、因子-κB(NF-κB)能與多種基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的κB序列位點(diǎn)特異結(jié)合，參與多種與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在慢性腎炎的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。而參與腎小球炎癥反應(yīng)的一系列炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)多含有κB序列位點(diǎn)，進(jìn)而受到NF-κB的調(diào)控。 中醫(yī)注重辨證論治，在慢性腎炎的治療方面擁有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。趙紹琴是我國(guó)著名的腎臟病學(xué)專家，“善用風(fēng)藥”是其臨床用藥的特色之一。本課題擬對(duì)趙老臨床經(jīng)驗(yàn)用方加以實(shí)驗(yàn)研究

3、，并根據(jù)其用藥特色對(duì)組方進(jìn)行歸類比較，以期部分闡明其作用機(jī)理，為臨床用藥提供理論依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)研究主要分以下三個(gè)部分進(jìn)行：第一部分，將清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠68只(體重150±10g)隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥Ⅰ組(“疏風(fēng)宣肺”藥物組)、中藥Ⅱ組(“涼血化瘀”藥物組)和中藥Ⅲ組(“疏風(fēng)宣肺、涼血化瘀、清利濕熱”藥物組)，正常組8只，其它各組15/組。對(duì)正常組以外的其他各組進(jìn)行預(yù)免疫，1周后正式免疫并開始給藥，每周

4、留取各組大鼠的24小時(shí)尿液并作尿蛋白定性及定量分析；于正式免疫第2、5、8周末，行心臟取血，離心、吸取上層血清，檢測(cè)各組大鼠血清中BUN、Cre、Alb、TG及Cho的含量；正式免疫8周后處死大鼠，摘取雙側(cè)腎臟，將右側(cè)腎臟以20％甲醛溶液固定一周后，經(jīng)脫水浸蠟，石蠟包埋、切片，行HE染色，進(jìn)而比較各組中藥對(duì)防治大鼠慢性血清病性腎炎的藥效學(xué)影響。 第二部分，采用石蠟切片免疫組化SP染色法檢測(cè)腎組織中NF-κBp65亞單位，并對(duì)結(jié)果

5、進(jìn)行圖像分析，借以觀察各組中藥對(duì)腎組織中NF-κBp65表達(dá)的影響，進(jìn)而初步探討疏風(fēng)宣肺等方藥防治大鼠慢性血清病性腎炎的作用機(jī)制。 第三部分，正式免疫8周后，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)各組血清中TNF-α、IL-8、IL-10的含量；將實(shí)驗(yàn)大鼠左側(cè)腎臟按1：9(W/V)比例加入0.9％生理鹽水，研磨制成勻漿，采用ELISA法檢測(cè)各組勻漿中TNF-α的含量，進(jìn)而從細(xì)胞因子的水平比較各組中藥對(duì)防治大鼠慢性血清病性腎炎的影響。

6、 結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正式免疫8周后，模型組大鼠的腎指數(shù)(g/Kg)顯著高于正常組(P＜0.01)，而中藥Ⅰ和Ⅲ組的腎指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05)；24小時(shí)尿蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明，模型組及中藥各組大鼠的24小時(shí)尿蛋白量自正式免疫第2周起即與正常組出現(xiàn)顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)，此后，模型組和中藥Ⅱ組的24小時(shí)尿蛋白量繼續(xù)升高，并在第6周左右達(dá)到最高峰，而中藥Ⅰ和Ⅲ組大鼠隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，與正常組大鼠24小時(shí)

7、尿蛋白量的差異漸趨不明顯(P＞0.05)，與模型組24小時(shí)尿蛋白量的差異卻愈見明顯(P＜0.01)；血清Alb的檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型及中藥Ⅱ組血清Alb的含量比正常組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，而Ⅰ、Ⅲ組中藥則可一定程度上阻止血清Alb的降低；而其它血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)也表明，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組血清BUN、Cr3、Cho和TG的含量均明顯高于正常組(P＜0.05)，而隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各中藥治療組血清

8、BUN、Cre、Cho和TG的含量均明顯低于模型組(P＜0.05)，尤以中藥Ⅰ、Ⅲ組更為明顯(P＜0.01)。此外，光鏡下觀察結(jié)果顯示，正式免疫8周后，模型組可見腎小球毛細(xì)血管壁彌漫性增厚，臟層上皮細(xì)胞肥大，腎小囊腔狹窄或消失，腎小球、腎小管及間質(zhì)區(qū)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小管中出現(xiàn)明顯的蛋白管型和白細(xì)胞增多；而中藥各組的病理改變相對(duì)較輕，毛細(xì)血管壁增厚及腎小囊腔狹窄現(xiàn)象明顯減輕，腎小球內(nèi)細(xì)胞增多不明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

9、減少，腎小管中少見蛋白管型，其中，中藥Ⅰ組的病理改變最輕，中藥Ⅲ組次之。 第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎組織中NF-κBp65在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)。其中，正常組大鼠的腎組織細(xì)胞漿呈淺棕色，偶見細(xì)胞核著棕黃色顆粒；正式免疫8周后，模型組大鼠腎組織的胞漿與核周均勻分布著棕黃色顆粒且明顯多于正常組，在腎小球部位，棕黃色顆粒多數(shù)已進(jìn)入細(xì)胞核；而中藥各組大鼠腎組織中NF-κBp65的陽(yáng)性表達(dá)主要集中在胞漿，腎小球部位的細(xì)胞核著色明顯淺于模

10、型組，尤以中藥Ⅰ、Ⅲ組較為明顯，圖象分析結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)(P＜0.01或P＜0.05)。 第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清/腎勻漿中TNF-α及血清IL-8、IL-10的含量均顯著高于正常組(P＜0.01)；中藥Ⅰ、Ⅲ組血清/腎勻漿中TNF-α的含量明顯低于模型組(P＜0.05)，中藥Ⅲ組血清IL-8的含量明顯低于模型組(P＜0.05)，而中藥各組血清IL-10的含量與模型組相比差異不顯著(P＞0.05)。 結(jié)論：第一

11、部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，中藥Ⅲ和中藥Ⅰ(“疏風(fēng)宣肺”組方藥物)可明顯改善腎功能和腎小球基底膜(GBM)的通透性，遏制CGN過(guò)程中的高脂血癥，減輕病變機(jī)體的免疫炎癥損傷，可能在降低免疫復(fù)合物沉積，并進(jìn)而減輕由免疫復(fù)合物引發(fā)的對(duì)腎小球的損害方面具有良好的效果；在降低蛋白尿、改善腎功能和血脂水平以及減輕腎小球免疫炎癥損傷方面有著較好的預(yù)防和治療作用。 第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，“疏風(fēng)宣肺”組方藥物可明顯抑制NF-κBp65亞單位的活化與核轉(zhuǎn)位，

12、繼而減弱NF-κBp65亞單位下游基因的生物學(xué)效應(yīng)，從而達(dá)到防治慢性腎炎的作用。 第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，“疏風(fēng)宣肺”組方藥物可減輕由促炎性細(xì)胞因子參與的免疫損傷，可能在糾正慢性腎炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)方面具有良好的效果；此外，由于IL-10的含量在中藥各組與模型組之間無(wú)顯著性差異，尚無(wú)法證實(shí)疏風(fēng)宣肺等方法在上調(diào)抗炎性細(xì)胞因子方面有明顯作用，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)可能有望明確其作用。 以上三部分實(shí)驗(yàn)提示，“疏風(fēng)宣肺”組方藥物在防治大