重組纖維連接蛋白肝素結(jié)合域多肽的制備及其對鼠敗血癥和彌漫性血管內(nèi)凝血治療作用的初步研究.pdf

1、本研究的主要內(nèi)容包括以下幾方面： 1．重組FNC端肝素結(jié)合域多肽昆蟲表達載體的構(gòu)建及多肽的制備根據(jù)FNcDNA序列，及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進行比對，確定纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHC-36)克隆位置，結(jié)合昆蟲表達pFastBacTMHTB載體的酶切特點，設(shè)計重組rhFNHC-36基因克隆的PCR擴增引物和酶切位點。利用所設(shè)計和合成的PCR引物，以FNcDNA為模板，PCR合成rhFNHC-36基因。將rhF

2、NHC-36基因克隆至pFastBacTMHTB載體上。重組載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，進行DNA序列測定。正確的克隆進一步擴增，提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)染DHlOBacTM感受態(tài)細胞，使目的基因在DH10BacTM感受態(tài)細胞中，借助Tn7轉(zhuǎn)座子的作用，轉(zhuǎn)移至大腸桿菌一昆蟲細胞的穿梭質(zhì)粒(bacmid)上，再通過藍白斑篩選，挑取白色的陽性克隆菌斑，提取質(zhì)粒。重組穿梭質(zhì)粒(bacmid-rhFNHC-36)

3、轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，以獲取重組的桿狀病毒。將重組的桿狀病毒-rhFNHC-36再次轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞表達rhFNHC-36多肽。由鎳柱分離純化rhFNHC-36多肽，SDS-PAGE分析，并經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計算分子量和其表達量。通過斑點雜交和westernblot方法，檢測多肽結(jié)合肝素能力和FN的抗原性。 2．重組FNN端肝素結(jié)合域多肽酵母表達載體的構(gòu)建及多肽的制備根據(jù)FNcDNA序列，及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進行比

4、對，確定纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29)克隆位置，結(jié)合酵母表達載體的酶切特點，設(shè)計rhFNHN-29基因克隆的PCR擴增引物和酶切位點。利用所設(shè)計和合成的PCR引物，以FNcDNA為模板，PCR合成rhFNHN-29基因。將rhFNHN-29基因克隆至pGEM-T載體上。將重組的pGEM-T-FNHN-29載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，進行DNA序列測定。正確的克隆進一步擴增，

5、提取重組pGEM-T-FNHN-29質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29基因連接到pAo815SM載體中。將重組的pAo815SM-FNHN-29載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，DNA序列測定和雙酶切鑒定，提取陽性克隆的重組pAo815SM-FNHN-29質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29基因連接到pPIC9K整合型酵母表達載體上。重組pPIC9K一FNHN-29載體轉(zhuǎn)染DH5

6、a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，進行DNA序列測定和雙酶切鑒定。正確的克隆進一步擴增，提取重組pPIC9K-FNHN-29質(zhì)粒。用BglⅡ酶切重組pPIC9K-FNHN-29質(zhì)粒，使其線性化。將線性化的pPIC9K-FNHN-29載體轉(zhuǎn)染GS115酵母細胞，進行篩選，挑選陽性克隆進行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)、鑒定rhFNHN-29多肽的表達量，挑選高水平表達的菌株進行大規(guī)模的表達。發(fā)酵液先用80％硫酸胺沉淀，沉淀物溶解后上

7、S一100柱和SP柱純化rhFNHN-29多肽。對純化的rhFNHN-29多肽進行SDS一PAGE分析，并經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計算其分子量。通過斑點雜交和westemb10t方法，檢測多肽結(jié)合肝素能力和FN的抗原性 。3．rhFNHN-29多肽對敗血癥小鼠作用的初步研究 應(yīng)用半乳糖胺增敏內(nèi)毒素敗血癥小鼠模型對rhFNHN-29多肽抗敗血癥作用進行研究。按LeistM等用半乳糖胺(Galactosamine，GalN)敏

8、化內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)建立敗血癥小鼠模型，即給每只小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和內(nèi)毒素(300μg)。建立敗血癥模型小鼠(BABL/C)共40只，雌雄各半，隨機分二組，每組20只，一組為rhFNHN-29多肽治療組，另一組為生理鹽水對照組。在給小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和內(nèi)毒素(300μg)前半小時，后l小時，2小時，3小時兩組小鼠分別從其尾靜脈注射rhFNHN-29多肽(10mg／kg

9、)和等體積生理鹽水。于腹腔注射藥物后6小時，眶靜脈采血250u1，枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，測定血漿TNFa水平，并觀察72小時小鼠生存率。腹腔注射藥物后72小時，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠的肝、腎、脾、肺、心、腦組織，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，做組織病理形態(tài)學(xué)觀察。同時取肝組織做電鏡觀察。 4．rhFNHN-29多肽對DIC大鼠作用的初步研究 應(yīng)用內(nèi)毒素誘導(dǎo)的DIC大鼠模型對rhFNHN-2

10、9多肽抗DIC作用進行研究。按TakahashiY等用內(nèi)毒素誘導(dǎo)法建立大鼠DIC模型的方法，即每只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg／kg)麻醉，股靜脈注射LPS(50mg／kg)。共建立DIC模型SD大鼠20只，體重200一250克，雌雄各半，隨機分兩組，每組10只，一組為rhFNHN-29多肽治療組，另一組為生理鹽水對照組。治療組分別于注射LPS前半小時，注射后2小時，4小時尾靜脈注射rhFNHN-29多肽(10mg／kg)，對照組注

11、射等體積生理鹽水。于注射LPS后6小時，對側(cè)股靜脈抽血5∞u1，50μ1EDTA抗凝，用于檢測白細胞(WBC)，血紅蛋白(№)，血小板(Plat)，450μl用4.5ul3．8％的枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，測定血漿TNFa水平。于股靜脈注射LPS后24小時處死大鼠，取大鼠的肝、腎、脾、肺、心、腦組織，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，做組織病理形態(tài)學(xué)觀察。 本研究取得如下結(jié)果和結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了重

12、組rhFNHC-36昆蟲表達載體，并在昆蟲細胞中表達及制備了rhFNHC-36多肽。成功構(gòu)建了重組rhFNHN-29酵母表達載體，并在酵母細胞中表達及制備了rhFNHN-29多肽。制備的rhFNHC-36矛口rhFNHN-29多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測定分子量，由昆蟲表達的多肽分子量為36.09kDa，由酵母表達的多肽分子量為28．52kDa。斑點雜交實驗證明兩多肽均能與肝素結(jié)合，但都不能與FN抗體結(jié)合。說明

13、所合成的多肽在體外具有結(jié)合肝素的能力而沒有FN的抗原性。同樣說明利用昆蟲和酵母表達系統(tǒng)表達FN肝素結(jié)合域多肽是可行的。 2．rhFNHN-29多肽對內(nèi)毒素敗血癥小鼠和DIC大鼠具有一定的治療作用。rhFNHN-29多肽治療小鼠敗血癥的實驗研究中，多肽治療組的死亡率為15％，對照組的死亡率為70％。rhFNHN-29多肽能明顯降低內(nèi)毒素敗血癥的死亡率(P

14、性與嚴重壞死，而多肽治療組的肝臟組織僅見局灶性的變性與輕微壞死。兩組的腎、脾、肺、心、腦等組織未見明顯病理改變。電鏡觀察，生理鹽水對照組肝細胞胞質(zhì)松散，染色變淺，細胞器崩解，而多肽治療組小鼠輕微變性，胞質(zhì)和細胞器均未見明顯改變，出現(xiàn)糖原和脂肪顆粒，并偶見少量凋亡細胞。 ELISA法檢測小鼠血漿TNFa水平，結(jié)果顯示生理鹽水對照組的TNFa水平顯著高于正常對照組小鼠的水平(P<0．01)，而用rhFNHN-29多肽治療小鼠的TNF

15、a水平顯著低于生理鹽水對照組(P＜0.O1)。 RT-PCR檢測實驗小鼠肝組織TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表達水平，結(jié)果顯示生理鹽水對照組小鼠的TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表達水平顯著高于正常對照組小鼠的水平(P＜0.01)，而用rgFNHN-29多肽治療的小鼠顯著低于生理鹽水對照組小鼠的水平(P＜0.01)， 在rhFNHN-29多肽治療LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠實驗研究中，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水

16、對照組肺組織小動脈和毛細血管出現(xiàn)廣泛血栓，肝小靜脈和毛細血管也出現(xiàn)廣泛血栓和廣泛出血，而rhFNHN-29多肽治療組僅見較輕微血栓形成和少量的出血。生理鹽水對照組的腎、脾、心、腦組織也見血栓形成和出血，而rhFNHN-29多肽治療組的腎、脾、心、腦組織見少量血栓形成，未見明顯出血。 乩ISA法檢測大鼠血漿TNFa水平，結(jié)果顯示生理鹽水對照組的TNFa水平顯著高于正常對照組(P＜0.01)，rhFNHN-29多肽治療組顯著低于生理