纖連蛋白及其重組肝素結(jié)合域多肽對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞具有非常重要的生理功能，主要體現(xiàn)在： 1.構(gòu)成天然屏障，維持血管內(nèi)膜光滑，防止血小板和白細(xì)胞粘附及有害物質(zhì)侵入血管壁； 2.組成滲透性屏障，調(diào)節(jié)物質(zhì)交換和主動轉(zhuǎn)運(yùn)功能； 3.參與血栓形成和止血過程，保持動態(tài)平衡，包括組織纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)等。許多病理狀態(tài)如嚴(yán)重感染、DIC等均涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能損害，繼而加劇病理性過程，形成惡性循環(huán)。因此如何恢復(fù)病理狀

2、態(tài)下失衡的血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)與功能一直是學(xué)術(shù)界研究的重點(diǎn)。纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)是一種廣泛存在于細(xì)胞外液、細(xì)胞表面及結(jié)締組織等處的糖蛋白。在抗感染、維持微血管完整性及通透性等方面具有重要的作用，故曾有“調(diào)理性α2表面結(jié)合蛋白”、“細(xì)胞表面蛋白”及“細(xì)胞粘附分子”之稱。已知FN主要分為細(xì)胞型和血漿型兩種，細(xì)胞型FN主要由內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞合成，它對于內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接及內(nèi)皮細(xì)胞附著于內(nèi)皮下層的膠原纖維起重要作用，從而保

3、證了微血管完整性。因此，研究外源性FN對某些病理因素造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)作用是很有價值的，鑒于從血漿分離FN存在著血漿資源不足和可能傳播血源性傳染病的問題，同時還由于FN分子量大，達(dá)450KD，全分子表達(dá)又存在技術(shù)上的難題。因此利用基因工程技術(shù)表達(dá)FN的功能區(qū)多肽并研究其功能，來代替FN可以說是一種可行的辦法。TNF-α是一種重要的炎性介質(zhì)，感染等病理情況下TNF-α增加，我們以往的研究表明，F(xiàn)N及肝素結(jié)合域多肽可防治脂多糖內(nèi)毒素

4、小鼠DIC的發(fā)生，其機(jī)制就涉及抑制TNF-α的表達(dá)。因此，根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)的目的在于建立TNF-α損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的模型及半乳糖胺增敏的內(nèi)毒素血癥小鼠模型，通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究FN及肝素結(jié)構(gòu)域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。 本研究內(nèi)容分為以下幾個部分： 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定采用酶消化法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；用免疫組化法檢測Ⅷ因子鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。 2.FN和兩

5、種肝素結(jié)合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP制備用明膠親和層析的方法從人新鮮血漿分離FN；經(jīng)SDS-聚丙烯凝膠電泳和免疫印跡(Western blot)法鑒定FN純度和特異性；兩種肝素結(jié)合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP由本研究所自行制備的酵母表達(dá)載體中表達(dá)和制備。 3.建立TNF-α損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型 3.1實(shí)驗(yàn)分組： (1)空白對照組：不加TNF-α處理的正常生長的HUVECs；

6、(2)不同濃度TNF-α處理組：分別用5ng/ml，10 ng/ml，20 ng/mlTNF-α作用18h； (3)不同時間TNF-α處理組：用l0 ng/mlTNF-α分別作用6h，12h，，18h，24h。 3.2用ELISA法檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中PAI-1、tPA、sICAM-1的含量4.研究FN及兩種肝素結(jié)合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對TNF-α作用的內(nèi)皮細(xì)胞的影響4.1實(shí)驗(yàn)分組： (

7、1)空白對照組：不加TNF-α處理的正常生長的HUVECs； (2)TNF-α作用組：l0ng/mlTNF-α作用18h，加入與多肽等體積的培養(yǎng)液6h； (3)TNF-α+FNNHBSPP作用組：l0ng/ml TNF-α作用18h，加入濃度為600ug/ml的FNNHBSPP作用6h： (4)TNF-α+FNCHBSPP作用組：l0ng/mlTNF-α作用18h，加入濃度為600ug/ml的FNCHBSPP作用

8、6h： (5)TNF-α+FN作用組：l0ng/mlTNF-α作用18h，加入濃度為600ug/ml的FN作用6h。 4.2用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察FN及其兩種肝素結(jié)合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對TNF-α損傷的內(nèi)皮細(xì)胞作用下的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu) 4.3用ELISA法檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中PAI-1、tPA、sICAM-1的含量5.研究FN及其兩種肝素結(jié)合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對

9、內(nèi)毒素血癥小鼠肝、肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 5.1建立半乳糖胺增敏的內(nèi)毒素血癥小鼠模型應(yīng)用半乳糖胺增敏內(nèi)毒素脂多糖建立內(nèi)毒素血癥小鼠模型，即給小鼠腹腔注射半乳糖胺(400mg/kg)和內(nèi)毒素(100ug/kg)。 5.2實(shí)驗(yàn)分組：正常組、內(nèi)毒素血癥組、FN作用組、FNNHBSPP作用組和FNCHBSPP作用組。在注射半乳糖胺及內(nèi)毒素前半小時從其尾靜脈分別注射FN、FNNHBSPP、FNCHBSPP(20mg/kg)，內(nèi)毒

10、素血癥組給等體積生理鹽水。 5.3病理形態(tài)學(xué)觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝、肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞腹腔注射藥物9小時后，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠的肝、肺組織，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，做病理形態(tài)學(xué)觀察。 5.4免疫組織化學(xué)法檢測肝、肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞纖維連接蛋白(FN)表達(dá)取得了以下結(jié)果與 結(jié)論： 1.建立了穩(wěn)定傳代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系。 2.建立了TNF-α損傷內(nèi)皮細(xì)胞的模型，

11、不同濃度的TNF-α(5，10，20ng/ml)作用于HUVECsl8h，培養(yǎng)液中PAI-1、sICAM-1的濃度與空白對照組相比，各組均增加(p<0.01)，其中以10ng/ml的TNF-α作用最明顯；用同一濃度10ng/ml的TNF-α作用6，12，18，24h，與空白對照組相比，PAI-1、sICAM-1的濃度均有明顯增高(p<0.01)，在18hTNF-α作用最明顯；tPA各組無明顯差異(p>0.05) 。 3.FN及其

12、肝素結(jié)合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP作用組的內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)液上清中PAI-1及sICAM-1的濃度均比TNF-α組明顯減低(p<0.01)，F(xiàn)N及兩種多肽的作用無明顯差異(p>0.05)。 4.建立了內(nèi)毒素血癥小鼠模型，予FN及多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP作用組的小鼠肝、肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞病變明顯減輕，血管內(nèi)皮細(xì)胞的FN表達(dá)比內(nèi)毒素血癥小鼠增強(qiáng)。 5.結(jié)論：FN及其多肽FNNHBSPP、FNCHBS