精原干細(xì)胞(SSCs)的建系及蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、近年來(lái)，不孕不育已成為日益嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。其中，由于男性因素導(dǎo)致的不育約占到不孕不育總數(shù)的一半。2010年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給英國(guó)科學(xué)家羅伯特·愛(ài)德華茲(Robert Edwards)，以表彰其在輔助生殖技術(shù)，特別是體外人工受精(In vitro fertilization，IVF)療法上的卓越貢獻(xiàn)。目前，全球超過(guò)10％的不育癥夫婦通過(guò)輔助生殖技術(shù)得到健康的子女。但是，由于技術(shù)的限制，包括IVF，卵胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytop

2、lasmic sperm injection，ICSI)在內(nèi)的輔助生殖技術(shù)都要求夫妻雙方提供成熟且健康的配子。因此對(duì)于無(wú)精子癥導(dǎo)致的男性不育患者，由于沒(méi)有成熟的雄性配子，不能接受輔助生殖的治療，目前唯一的解決方式是借助精子庫(kù)的精子受精，因而不能夠得到生物學(xué)意義上的子代。而在無(wú)精子癥患者中，真正的唯支持細(xì)胞綜合征患者只占到17％，大多數(shù)患者睪丸中仍存在正常的精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)。SSC

3、s是睪丸中維持雄性哺乳動(dòng)物精子發(fā)生的成體干細(xì)胞，它一方面具有自我更新的能力，另一方面又可以分化出可以進(jìn)行減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞，最終形成雄性配子。因此SSCs具有臨床治療無(wú)精癥的潛在價(jià)值。在基礎(chǔ)研究中，SSCs不但可以作為研究干細(xì)胞增殖分化研究的平臺(tái)。更重要的是，SSCs在基因編輯，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠上，有著不可替代的優(yōu)勢(shì)。由于SSCs所分化出的單倍體雄性配子是遺傳物質(zhì)的直接攜帶者，因此在SSCs上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作再結(jié)合生殖細(xì)胞移植技術(shù)可以非常便

4、利的得到帶有轉(zhuǎn)基因的雄性配子，進(jìn)而方便的得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。同時(shí)，在對(duì)于雄性生殖細(xì)胞基因功能的研究中，利用SSCs進(jìn)行基因敲除，不但可以在體外培養(yǎng)時(shí)直接觀察所研究的基因?qū)τ赟SCs增殖及自我更新的影響，更重要的是，通過(guò)SSCs的移植實(shí)驗(yàn)，可以直接觀察基因敲除的SSCs在遷移及后續(xù)分化，包括精母細(xì)胞減數(shù)分裂及精子變形中的表型，比傳統(tǒng)的構(gòu)建基因敲除模型后觀察其睪丸中的表型有非常大的便利。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：我們?cè)隗w外建立了

5、三株小鼠SSCs細(xì)胞系。這些細(xì)胞系均可以在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，仍維持增殖的能力。基因表達(dá)分析結(jié)果顯示SSCs細(xì)胞系與體內(nèi)SSCs基因表達(dá)模式相同。將體外培養(yǎng)的SSCs移植到小鼠睪丸的曲細(xì)精管中，SSCs能夠在受體小鼠睪丸中定居，增殖，并進(jìn)行了正常的精子發(fā)生過(guò)程。將移植了SSCs的受體鼠與野生型母鼠交配或進(jìn)行ICSI后，都可以得到正常出生的，帶有與SSCs相同的轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的子代動(dòng)物，證實(shí)這些經(jīng)過(guò)體外多代培養(yǎng)的SSCs具有良好的發(fā)育潛能。

6、r>　　第二部分：針對(duì)SSCs在單倍體生成及轉(zhuǎn)基因操作中的應(yīng)用，本文進(jìn)行了一些嘗試。傳統(tǒng)方法中，要將在體外傳代培養(yǎng)的SSCs進(jìn)一步分化成單倍體的精子，需要將其移植到受體小鼠曲細(xì)精管的微環(huán)境中。而在人類，將體外培養(yǎng)的細(xì)胞移植回病人的睪丸存在著安全隱患。同時(shí)對(duì)于那些睪丸微環(huán)境破壞或者睪丸內(nèi)體細(xì)胞不能支持生精的病人來(lái)說(shuō)，SSCs睪丸移植不能解決這些問(wèn)題。因此，其他的使SSCs進(jìn)行精子分化的方法迫切需要被開(kāi)發(fā)出來(lái)。SSCs在體內(nèi)所處的微環(huán)境需要

7、睪丸內(nèi)各種體細(xì)胞參與構(gòu)建，因此我們利用SSCs和新生小鼠睪丸體細(xì)胞在體外聚合，之后移植到受體小鼠的腎包膜下。移植后兩周可形成完整的生精上皮結(jié)構(gòu)，并在重構(gòu)的曲細(xì)精管中分選到單倍體細(xì)胞。我們利用單倍體的圓形精子細(xì)胞進(jìn)行ICSI之后，得到了健康出生的子代小鼠。這些結(jié)果說(shuō)明我們利用睪丸體細(xì)胞與在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的SSCs在異位重建了曲細(xì)精管的微環(huán)境，并維持了正常的精子發(fā)生過(guò)程，為在體外實(shí)現(xiàn)減數(shù)分裂得到配子打下了基礎(chǔ)。而在基因編輯方面，由于SSC

8、s在體外培養(yǎng)時(shí)增殖周期長(zhǎng)，易于分化且不易接受外源基因整合等特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行基因編輯十分困難，成功率也非常低。我們嘗試使用最新的CRISPR Cas9基因打靶技術(shù)，對(duì)SSCs上進(jìn)行基因編輯。結(jié)果證實(shí)，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，我們成功并高效的敲除了帶有GFP標(biāo)記的SSCs中的GFP序列，使SSCs熒光消失。此工作證明，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以對(duì)SSCs進(jìn)行定點(diǎn)的基因打靶，且可以獲得較高的效率。
　　第三部分：雖然部分參

9、與SSCs增殖及分化調(diào)節(jié)的信號(hào)通路被揭示出來(lái)，但是由特異表達(dá)蛋白組成的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)SSCs增殖與分化的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。為了深入了解SSCs中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，從整體水平揭示這些蛋白可能參與的生物學(xué)事件，并尋找出SSCs自我更新及分化所依賴的新蛋白分子，我們對(duì)已建立的SSCs細(xì)胞系進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，鑒定到一些新的SSCs特異的表面分子，可以用于SSCs的分離和富集，同時(shí)鑒定出新的SSCs特異表達(dá)蛋白并分析了其可能參與的信號(hào)通路