人深齲牙髓干細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)分析及候選基因Stathmin功能的初步研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 隨著社會老齡化的發(fā)展，牙齒缺失已經(jīng)成為影響人類生活質(zhì)量和健康的重要因素。而我國作為一個發(fā)展中的人口大國，由于人們衛(wèi)生意識和醫(yī)療條件的限制，牙齒缺失的發(fā)生率在人群中相當(dāng)高。由于目前的各種修復(fù)方法存在種種弊端，因此，如何使牙齒再生，一直是口腔醫(yī)學(xué)研究者們追逐的夢想。近年來，隨著組織工程、干細(xì)胞等技術(shù)的不斷進步，我們離擁有“第三副牙齒”的夢想也越來越近了。在構(gòu)建組織工程牙齒過程中，礦化能力已成為種子細(xì)胞能否成功

2、形成牙體硬組織的關(guān)鍵因素。學(xué)者們不斷探索牙齒生物礦化的調(diào)控機制。然而，到目前為止，我們對牙齒發(fā)育過程中的礦化調(diào)控機制尚未完全了解。
　　 生物礦化過程是一個精密調(diào)控的生理過程。Mann等人認(rèn)為生物體內(nèi)的礦化過程可分為三個階段:
　　 (1)超分子預(yù)組裝(Supramolecular Preorganization):在礦物沉積前構(gòu)造出一個高度有序的反應(yīng)環(huán)境，該環(huán)境決定了無機礦物成核的位置。
　　 (2)分子界面識

3、別(Interfacial Molecular Recognition):在已形成的超分子框架的控制下，無機礦物質(zhì)于無機/有機界面處自溶液中成核。
　　 (3)細(xì)胞調(diào)控(Cellular Processing):已形成的礦物晶核在超分子框架的控制下繼續(xù)生長，在細(xì)胞的參與下組裝成高級結(jié)構(gòu)，其中生物礦物晶體被賦予了獨特的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，并產(chǎn)生了復(fù)雜的微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)組織。
　　 人體中的硬組織，如牙齒、骨骼，都是生物礦化過程的產(chǎn)

4、物。在生理條件下，通過細(xì)胞的參與、調(diào)節(jié)，各種生物活性因子有序作用，人體生成了具有特殊形態(tài)和功能的硬組織（礦化組織）。而在體外利用物理或化學(xué)的方法，合成類似的礦化物則需要相當(dāng)苛刻的條件。因此，生理條件下的礦化，細(xì)胞和各種生物活性因子的調(diào)控是起到?jīng)Q定性作用的。但如何在體外條件下重現(xiàn)細(xì)胞及各種生物活性因子的調(diào)控作用，一直是生物礦化研究領(lǐng)域密切關(guān)注并亟待解決的問題。
　　 自2000年發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞以來，學(xué)者對其展開了深入研究，以牙髓干

5、細(xì)胞為模型尋找促進礦化的方法，探討礦化機制。從牙髓中分離培養(yǎng)的成體干細(xì)胞在體外和支架材料復(fù)合后，移植到動物體內(nèi)，已成功獲得了類似牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。到目前為止，學(xué)者們對牙髓干細(xì)胞的研究主要集中于正常牙髓干細(xì)胞，然而，在體牙髓干細(xì)胞形成修復(fù)性牙本質(zhì)是當(dāng)牙齒受到磨損、齲損等慢性刺激的情況下發(fā)揮作用的，那么深齲下牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性有何改變，發(fā)生這種變化的原因何在呢？
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來發(fā)展起來的在生命科學(xué)乃至自然科學(xué)領(lǐng)

6、域最活躍的學(xué)科。本課題從正常牙髓干細(xì)胞和深齲牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)差異出發(fā)，利用高通量的雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)學(xué)策略，篩選與礦化相關(guān)的蛋白，并對該蛋白的功能進行驗證，研究結(jié)果為探索牙髓干細(xì)胞的礦化機制及尋找礦化標(biāo)記物提供了理論依據(jù)。
　　 本論文主要包括以下四章內(nèi)容:
　　 第一章:深齲牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 本章實驗主要比較組織塊法、酶消化法、及改良組織塊酶消化法分別分離培養(yǎng)8例共24例深齲牙髓

7、干細(xì)胞，并利用正常牙髓干細(xì)胞做對照，結(jié)果表明組織塊法、酶消化法及改良組織塊酶消化法均可以培養(yǎng)出人齲壞牙髓干細(xì)胞。改良組織塊酶消化法采用蓋玻片輕壓組織塊的方法，保證組織塊能牢固的貼附于孔板上，經(jīng)酶消化的組織塊變得松散，有利于培養(yǎng)液滲透到組織塊內(nèi)，顯微鏡下觀察組織塊透光性好，有利于細(xì)胞從組織塊內(nèi)游出，本實驗證明利用改良組織塊酶消化法將正常和深齲牙髓組織接種4、5天后即有細(xì)胞從組織塊內(nèi)游出，并且可以形成明顯的細(xì)胞暈，可以培養(yǎng)出狀態(tài)良好的深齲牙

8、髓干細(xì)胞。改良組織塊酶消化法保證了在較短的時間內(nèi)獲得大量的細(xì)胞，是一種理想的原代培養(yǎng)方法，為我們后續(xù)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 第二章:正常與深齲牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較
　　 為了比較正常和深齲牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的差異，我們利用MTT、流式細(xì)胞儀及檢測克隆形成能力的方法比較了兩種細(xì)胞增殖能力的差異;礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)正常和深齲牙髓干細(xì)胞后，比較兩者形成礦化結(jié)節(jié)的能力，堿性磷酸酶試劑盒檢測ALP活性，qRT-PCR檢測成

9、骨相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明，深齲牙髓干細(xì)胞較正常牙髓干細(xì)胞表現(xiàn)出了較強的增殖能力。經(jīng)礦化誘導(dǎo)后深齲牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力強于正常牙髓干細(xì)胞，同時也表現(xiàn)出了較強的ALP活性;qRT-PCR結(jié)果表明深齲牙髓干細(xì)胞內(nèi)成骨成牙標(biāo)記物的表達(dá)量較正常牙髓干細(xì)胞顯著增高。
　　 第三章:深齲牙髓干細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 為了更好的理解牙髓干細(xì)胞的礦化機制，尋找深齲牙髓干細(xì)胞與正常牙髓干細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)特性差異的原因，本實驗運用

10、熒光雙向差異凝膠電泳對正常和深齲牙髓干細(xì)胞進行電泳分析，軟件分析正常和深齲牙髓干細(xì)胞蛋白表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)20個蛋白質(zhì)斑點在兩組凝膠中有顯著性表達(dá)差異，其中有10個在深齲牙髓干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，10個在深齲牙髓干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定的相關(guān)蛋白，采用免疫印跡對篩選的部分差異蛋白(TCP-1，Stathmin)進行驗證。并探討候選蛋白在參與礦化過程可能發(fā)揮的作用。
　　 第四章:Stathmin蛋白生物學(xué)作用的基本機制探討

11、　　 Stathmin是本實驗篩選的礦化相關(guān)蛋白之一，又稱p17，p18，p19，Op18，19K，Op18/Stathmin Metablastin等，是近年來發(fā)現(xiàn)的在序列上高度保守的，在細(xì)胞的增殖和分化中十分重要的可溶性微管輔助蛋白。Stathmin由149個氨基酸組成，分子量19kD，pH515～612，有兩個不同的亞型α/β。蛋白質(zhì)組學(xué)篩選并鑒定Stathmin在正常牙髓干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，目前關(guān)于其對牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

12、尚未見報道。為了探討Stathmin對牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，我們構(gòu)建了Stathmin過表達(dá)和表達(dá)抑制的載體，并轉(zhuǎn)染到正常牙髓干細(xì)胞內(nèi)，qRT-PCR驗證過表達(dá)及沉默效率。過表達(dá)Stathmin后牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力顯著增強，表達(dá)成骨相關(guān)基因(BSP、RUNX2、OCN)的量也較對照組顯著增強;沉默Stathmin后牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力顯著減弱，同時可以下調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。綜合以上結(jié)果Stathmin對牙髓干細(xì)

13、胞的礦化能力具有一定調(diào)控作用，并呈正相關(guān)，本實驗為揭示牙髓干細(xì)胞礦化機制，促進牙髓干細(xì)胞礦化能力提供新的思路。
　　 材料方法:
　　 牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng):
　　 標(biāo)本取自南方醫(yī)院口腔頜面外科，收集臨床18-22歲患者因阻生而拔除的健康、完整的智齒為正常組，有深齲，剩余牙本質(zhì)厚度約2mm，無自發(fā)痛等牙髓炎癥狀的智齒為深齲組（經(jīng)患者本人及家屬知情同意），牙齒拔除后置于PBS緩沖液內(nèi)送至實驗室，沿釉牙骨質(zhì)界用高速手

14、機環(huán)繞牙頸部磨出一定深度的溝槽，注意不能穿髓。在超凈臺內(nèi)將牙齒沿溝槽劈開，無菌條件下取出牙髓（去除根尖孔端約2mm的牙髓）置于PBS緩沖液內(nèi)。反復(fù)漂洗至少3次，對于深齲牙髓組織至少漂洗5次。
　　 細(xì)胞增殖能力的檢測:
　　 流式鑒定細(xì)胞周期:
　　 收集5×105/mL正常牙髓干細(xì)胞和深齲牙髓干細(xì)胞，根據(jù)實驗步驟，流式細(xì)胞儀上機，行細(xì)胞周期檢測、分析。
　　 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況:
　　 取

15、對數(shù)生長期的第3代細(xì)胞，將正常牙髓干細(xì)胞和深齲牙髓干細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于96孔板，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm波長下各孔光吸收值，求均值。
　　 克隆形成實驗:
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整每組細(xì)胞密度至10～15個/mL，吹打混勻，接種子96孔板內(nèi)，常規(guī)倒置顯微鏡下觀察克隆形成情況，21d后甲苯胺藍(lán)染色并計算形成克隆數(shù)（以≥50個細(xì)胞為一個克?。?。
　　 堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化誘導(dǎo):

16、
　　 為了比較細(xì)胞ALP水平變化情況，將正常牙髓干細(xì)胞和深齲牙髓干細(xì)胞分別按5×103個/孔接種于96孔板內(nèi)，按照ALP試劑盒說明操作，檢測各組細(xì)胞的ALP活性，空白孔調(diào)零，檢測520 nm下各孔吸光度(OD)值，檢測細(xì)胞的ALP活性。正常牙髓干細(xì)胞和深齲牙髓干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液以1×104細(xì)胞/孔接種于24孔板，茜素紅染色法鑒定礦化結(jié)節(jié)。
　　 雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì):
　　 正常和深齲牙髓干細(xì)胞熒光雙向凝膠電

17、泳，等點聚焦電泳和SDS-PAGE凝膠電泳，質(zhì)譜分析，文獻(xiàn)回顧篩選相關(guān)蛋白，免疫印跡驗證。
　　 qRT-PCR:
　　 抽提細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用sybgreen法進行PCR擴增，通過相對定量以2-△△ct值代表基因的相對表達(dá)強度。
　　 Western blot:
　　 抽提細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白濃度測定，10％ SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影及定影，蛋白相對表

18、達(dá)強度采用Quantity One軟件進行定量。
　　 病毒獲取:
　　 過表達(dá)Stathmin慢病毒表達(dá)載體:以正常人外周血為模板，擴增Stathmin目的基因，并將其連接到GV261載體，包裝細(xì)胞用:293T細(xì)胞，獲得充足質(zhì)粒GV261-Stathmin。
　　 沉默Stathmin慢病毒表達(dá)載體為pGLV-H1-GFP+Puro，包裝系統(tǒng)為PGPackaging Plasmid Mix，包裝細(xì)胞:293T細(xì)

19、胞，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司包裝。
　　 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:
　　 慢病毒感染:將慢病毒懸液按照不同的病毒感染復(fù)數(shù)感染正常牙髓干細(xì)胞，48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(green fluorescent protein，GFP)發(fā)光情況。鑒于慢病毒感染效率較高，以GFP為標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞分選獲得GFP陽性細(xì)胞，分別建立過表達(dá)Stathmin、穩(wěn)定干擾Stathmin的正常牙髓干細(xì)胞。
　　 統(tǒng)計學(xué)分析:

20、r>　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，MTT、ALP采用重復(fù)測量的方差分析，檢測沉默Stathmin的qRT-PCR采用單因素方差分析，正常和深齲牙髓干細(xì)胞克隆形成率、qRT-PCR檢測正常和深齲牙髓干細(xì)胞礦化相關(guān)基因時采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，其他涉及到兩組數(shù)據(jù)比較均采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.深齲牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性
　　

21、 本實驗利用酶消化法、組織塊法、組織塊酶消化法均可分離培養(yǎng)出深齲牙髓干細(xì)胞，但改良組織塊酶消化可以在短時間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，是一種較好的原代培養(yǎng)方法。流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，與正常牙髓干細(xì)胞相比，深齲牙髓干細(xì)胞表達(dá)間充干細(xì)胞標(biāo)記物(Stro-1、CD90、CD105)的含量顯著增高，表明深齲牙髓干細(xì)胞較正常牙髓干細(xì)胞有更強的干細(xì)胞特性(Stro-1: t=3.325, P=0.029; CD90: t=4.446, P=

22、0.011; CD105: t=3.411, P=0.027)。將兩種牙髓干細(xì)胞三向誘導(dǎo)，結(jié)果表明正常和深齲牙髓干細(xì)胞均具有成脂成骨及成軟骨的能力，且深齲牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力的強于正常牙髓干細(xì)胞。
　　 為了比較兩種細(xì)胞的增殖能力，本實驗分別采用MTT、細(xì)胞周期、及檢測細(xì)胞克隆形成能力的方法，從三方面比較正常和深齲牙髓干細(xì)胞增殖能力的差異。MTT結(jié)果顯示從第3天開始深齲牙髓干細(xì)胞較正常牙髓干細(xì)胞表現(xiàn)出較高的OD值，通過7

23、天的比較，結(jié)果表明深齲牙髓干細(xì)胞較正常牙髓干細(xì)胞具有較強的增殖能力（F=7.350，P=0.000）;細(xì)胞周期顯示深齲牙髓干細(xì)胞G2M+S期細(xì)胞比例高于正常牙髓干細(xì)胞;同時深齲牙髓干細(xì)胞較正常牙髓干細(xì)胞表現(xiàn)出了較強的克隆形成能力(t=9.798，P=0.001)。
　　 為了比較兩種細(xì)胞的礦化能力，將正常和深齲牙髓干細(xì)胞分別礦化誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后深齲牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力強于正常牙髓干細(xì)胞，同時深齲牙髓干細(xì)胞也表現(xiàn)出了較強的AL

24、P活性(t=191.741，P=0.000）;qRT-PCR結(jié)果表明深齲牙髓干細(xì)胞內(nèi)成骨成牙標(biāo)記物OCN(t=3.989，P=0.003)、RUNX2(t=3.588，P=0.005)、ALP(t=6.044, P=0.000)、Osteonetin(t=2.270, P=0.047)、DSPP(t=-3.094，P=0.011)、BSP(t=5.847，P=0.000)的表達(dá)量較正常牙髓干細(xì)胞顯著增高。
　　 2.深齲牙髓干細(xì)

25、胞蛋白質(zhì)組學(xué)及候選蛋白的生物學(xué)特性
　　 熒光雙向差異凝膠電泳分析正常和深齲牙髓干細(xì)胞差異表達(dá)蛋白，質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)20個蛋白質(zhì)斑點在兩組凝膠中有顯著性表達(dá)差異，其中有10個在深齲牙髓干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，10個在深齲牙髓干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。并采用免疫印跡對篩選的部分差異表達(dá)蛋白進行驗證，經(jīng)文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)Stathmin與礦化關(guān)系密切。因此，我們構(gòu)建了Stathmin過表達(dá)和表達(dá)抑制載體，并轉(zhuǎn)染到正常牙髓干細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果表明上調(diào)Stathm

26、in的表達(dá)可以增強牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力及顯著上調(diào)成骨相關(guān)基因BSP(t=-3.179，P=0.034)、OCN(t=-4.104，P=0.015)、RUNX2（t=-3.565，P=0.023）的表達(dá);下調(diào)Stathmin在牙髓干細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)后牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力下降，同時顯著下調(diào)成骨相關(guān)基因BSP(t=7.736,P=0.002)、OCN(t=3.670,P=0.021)、RUNX2(t=3.309, P=0.030)