鈦表面透明質酸微圖形調控血管內膜形成的研究.pdf

1、心血管植入材料表面內皮化被認為是防止植入后血栓和內膜增生的主要途徑，因此提高這類生物材料的表面內皮化質量是非常重要和有意義的。目前，體外研究證明在生物材料表面覆蓋完整的內皮層具有一定的抑制血栓形成和平滑肌細胞增生的作用。但是，這種材料表面單一細胞形成的內膜植入體內后，存在抗凝血功能不足和容易大面積脫落等問題。為了解決這一問題，更多的研究轉向如何實現(xiàn)體內內皮化，但對材料表面內皮細胞周細胞環(huán)境和仿流體剪切力環(huán)境的構建與改善的研究也不可缺少。

2、基于此，本文在構建與改善材料表面內皮細胞周細胞環(huán)境和仿流體剪切力環(huán)境的基礎上，進行了材料表面仿生內膜構建的相關研究。
　　本文采用具有較好生物相容性的鈦(Ti)作為基底材料，利用Ti表面透明質酸(HA)條帶微圖形模擬體內流體剪切力對內皮細胞(ECs)的拉伸力學作用;利用微圖形對平滑肌細胞(SMCs)的限制作用為內皮細胞提供仿生的平滑肌周細胞環(huán)境;同時構建了利用透明質酸酶(HAa)水解HA以實現(xiàn)ECs和SMCs的有序共培養(yǎng)(SMCs

3、-HAa-ECs)和利用四型膠原(ColⅣ)屏蔽HA的阻抗效果以實現(xiàn)ECs和SMCs的有序共培養(yǎng)(SMCs-ColⅣ-ECs)兩種血管內皮細胞和平滑肌細胞的共培養(yǎng)模型，并在此基礎上初步實現(xiàn)了Ti金屬表面血管仿生內膜構建，同時對該內膜的生物學功能進行了評價。首先，研究了P10/40(HA條紋寬度10μm;裸露的堿活化Ti條紋寬度40μm)、P25/25(HA條紋寬度25μm;裸露的堿活化Ti條紋寬度25μm)、P40/10(HA條紋寬度4

4、0μm;裸露的堿活化Ti條紋寬度10μm)三種微圖形尺寸對內皮細胞的形態(tài)、增殖、功能性因子分泌和抗凝血功能的影響，篩選出最適合臍靜脈內皮細胞生理功能發(fā)揮的微圖形尺寸。其次，在此基礎上構建了“SMCs-HAa-ECs”和“SMCs-ColⅣ-ECs”兩種血管內皮細胞和平滑肌細胞的共培養(yǎng)模型。通過對比兩個模型中內皮細胞形態(tài)、數(shù)量、抗凝血因子分泌功能、抗凝血功能以及抗切應力功能，篩選出更適合Ti基底血管仿生內膜的共培養(yǎng)模型。最后，在前一步篩選

5、的基礎上通過對平滑肌細胞初始種植密度的優(yōu)化，實現(xiàn)了Ti表面血管仿生內膜的初步構建，并對構建的仿生內膜進行了功能評價。綜合利用掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、水接觸角分析、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、免疫熒光染色分析等方法對Ti表面透明質酸微圖形的物化性能和穩(wěn)定性進行了表征。運用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和免疫熒光染色分析方法對內皮細胞的形態(tài)、數(shù)量和分泌功能進行了評價，尤其是運用雙

6、染方法觀察共培養(yǎng)體系中內皮細胞和平滑肌細胞的形態(tài)和行為。運用細胞形態(tài)測量和計算軟件(ImageJ)統(tǒng)計出內皮細胞的形態(tài)指數(shù)。通過血小板粘附和激活實驗、活化部分凝血酶時間(APTT)、血漿凝血酶原時間(PT)實驗對內皮細胞抗凝血功能進行了評價。在流動腔裝置內模擬人體主動脈血流剪切力對材料表面內皮細胞的抗剪切力功能進行了評價。
　　本文的另一個相關工作是結合Ti表面透明質酸微圖形對內皮細胞的調控和脫細胞技術在Ti基底上構建了透明質酸微

7、圖形和內皮細胞外基質交錯分泌的表面，并對該表面進行了纖維蛋白原變性、內皮祖細胞粘附與抗凝血功能、平滑肌細胞粘附和巨噬細胞粘附等生物相容性評價。
　　全文主要結果如下:
　　1、透明質酸微圖形制備到Ti基底表面，該二維微圖形具備較好的結構穩(wěn)定性和功能穩(wěn)定性。P10/40、P25/25、P40/10三個尺寸的微圖形中P25/25更適合內皮細胞生理功能的發(fā)揮，包括形態(tài)仿生、功能性因子的分泌及抗凝血功能等。
　　2、透明質酸微

8、圖形表面本身的血液相容性并不理想，但是通過微圖形調控內皮細胞形態(tài)和細胞外基質的合成，再結合脫細胞技術可獲得圖形化分布的內皮細胞外基質。初步生物學評價結果顯示，該細胞外基質表面具有較好的抑制纖維蛋白原變性功能、促內皮祖細胞粘附、有序分布和抗凝血功能，抑制平滑肌細胞粘附和促進平滑肌細胞表型收縮功能，以及抑制巨噬細胞粘附的功能。
　　3、通過透明質酸酶的加入可改變透明質酸阻抗細胞粘附的作用，實現(xiàn)了“SMCs-HAa-ECs”共培養(yǎng)體系的

9、構建;利用ColⅣ的引入屏蔽透明質酸對內皮細胞的阻抗作用，實現(xiàn)了“SMCs-ColⅣ-ECs”共培養(yǎng)體系的構建;通過兩套模型中內皮細胞抗凝血因子的分泌、抗凝血功能、抑制平滑肌細胞增生功能和抗流體剪切力功能的綜合比較，發(fā)現(xiàn)“SMCs-ColⅣ-ECs”共培養(yǎng)模型具有更大的生物學優(yōu)勢。
　　4.在“SMCs-ColⅣ-ECs”共培養(yǎng)模型的基礎上，利用內皮細胞和平滑肌細胞的初始種植密度差(1×105 cells/ml∶2.5×104 c