Ad-hVEGF-,121-重組腺病毒基因治療對(duì)急性心肌梗死大鼠心臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立大鼠急性心肌梗死模型，將以腺病毒為載體的人血管內(nèi)皮生長因子(Ad-hVEGF121)注射感染至心肌內(nèi)，觀察其對(duì)缺血心肌血管生成、心室結(jié)構(gòu)和功能以及心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討其治療心肌梗死的可能機(jī)制。 方法：1.構(gòu)建hVEGF121腺病毒表達(dá)載體。利用293T細(xì)胞包裝擴(kuò)增Ad-hVEGF121重組腺病毒，獲取大量含hVEGF121的腺病毒；用PCR法鑒定擴(kuò)增的腺病毒；用光密度法在0D260測定腺病毒滴度。2.將78只清潔級(jí)

2、雄性SD大鼠，體重250～300g隨機(jī)分為四組：心梗+VEGF感染組(AMI/VEGF組)，心梗+生理鹽水組(MI/NS組)，單純心梗組(AMI組)和假手術(shù)組(sham組)。VEGF組、MI/NS組、AMI組都行結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支而假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。3.結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后穩(wěn)定10～15分鐘，VEGF組和MI/NS組用微量注射器分別向心肌梗死區(qū)分三點(diǎn)直接注射Ad-hVEGF121或NS(每點(diǎn)20μl，總量為×1010vp)，AMI組結(jié)扎后

3、關(guān)閉胸腔，術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)2周。術(shù)后14天行心臟超聲檢查左室結(jié)構(gòu)和心功能。超聲檢查后處死大鼠，取出心臟剪去心房和右室，將室間隔保留在左室，垂直于左室長軸將左室分成上下兩部分，上部分置-80℃凍存，用于提取總RNA并用RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、caspase-3及hVEGF121的mRNA表達(dá)。下部分經(jīng)甲醛固定后，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，計(jì)算梗死面積；免疫組化vWF染色計(jì)數(shù)毛細(xì)血管密度；TUNEL法計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡率。

4、 結(jié)果：1.用293T細(xì)胞包裝擴(kuò)增的Ad-hVEGF121腺病毒，擴(kuò)增后病毒滴度為1.155×1012v.p/ml。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為476bpDNA片段，顯示成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-hVEGF121。2.阻斷大鼠冠狀動(dòng)脈前降支血流后，心電圖顯示ST段抬高，QRS綜合波幅度增高，術(shù)后14天的大鼠心臟大體標(biāo)本可見左室局部蒼白，室壁明顯變薄，無血管瘤生成。HE染色可見左室前壁局部穿壁梗死灶。模型成功率67.9％。3.實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，心肌梗

5、死各組大鼠的體重較sham組大鼠明顯減輕(p<0.01)。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，心肌梗死大鼠均表現(xiàn)LVEDd和LVEDs增大，與sham組大鼠比較有顯著差異(p<0.05)。直接心肌注射Ad-hVEGF121能在一定程度縮小大鼠左室內(nèi)徑和左室重量/體重比值，增加LVEF，但與MI/NS和HI組大鼠比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。4.HE染色結(jié)果顯示，除sham組外，各組間梗死面積無顯著差異(p>0.05)。免疫組化vWF陽性內(nèi)皮細(xì)胞測量

6、結(jié)果顯示：心肌梗死大鼠新生毛細(xì)血管密度較sham組顯著增多(p<0.001)，轉(zhuǎn)染rAd-hVEGF121大鼠新生毛細(xì)血管密度較MI/NS組和AMI組增加(p<0.05)。5.RT-PCR結(jié)果顯示，AMI后2周，梗死組大鼠梗死區(qū)bcl-2、bax和caspase-3的mRNA表達(dá)明顯增加，與sham組比較有顯著差異(p<0.01)。但轉(zhuǎn)染rAd-hVEGF121大鼠的bcl-2和bax的mRNA表達(dá)灰度值與AMI和MI/NS組比較無差異

7、(p>0.05)。TUNEL結(jié)果顯示，VEGF組心肌細(xì)胞凋亡率較MI/NS組和AMI組顯著降低(p<0.05)，而且以梗死周圍區(qū)凋亡明顯。 結(jié)論：1.結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支能成功構(gòu)建穩(wěn)定的急性心肌梗死大鼠模型；2.直接心肌注射Ad-hVEGF121(1×1010vp)能在一定程度改善心肌梗死大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能，這可能與其增加新生毛細(xì)血管密度，降低心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)：3.Ad-hVEGF121并非通過上調(diào)凋亡抑制因子bcl-2和下