自噬增強對小鼠急性心肌梗死的保護作用研究.pdf

1、第一部分自噬在小鼠急性心肌梗死中的變化研究
　　目的：
　　急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是威脅人類健康的常見心血管疾病。自噬（autophagy）是細胞進行自體清除的方式，在應(yīng)激下可被激活。但是自噬在AMI中的作用及其機制尚不明確。本實驗通過永久性結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支（Left Anterior Descending，LAD）造成小鼠AMI模型，觀察AMI7天和21天小鼠

2、心肌組織中自噬的改變。
　　方法：
　　C57BL/6小鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組,小鼠LAD只穿線，不結(jié)扎，n=14）和急性心肌梗死組（AMI組，行小鼠 LAD結(jié)扎術(shù)，n=24）。于實驗結(jié)束前一天用高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心臟功能；隨后處死小鼠取心臟分別進行以下實驗：TTC染色法檢測梗死面積的變化情況；HE染色法檢測心肌形態(tài)學(xué)的變化情況；透射電子顯微鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu)的變化情況；Western-blot方法檢

3、測自噬相關(guān)蛋白LC3B表達水平的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.與Sham組相比，AMI7天、21天后小鼠的心臟體重比顯著增加（P<0.05）。超聲心動圖結(jié)果顯示：與Sham組相比，AMI7天、21天后小鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）和舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)顯著增加，左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(LVFS)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2. TTC染色結(jié)果顯示：與Sham組相比

4、，AMI7天和21天后小鼠左心室梗死面積顯著增加（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示AMI7天和21天后小鼠左心室前壁變薄，心肌細胞變性、丟失嚴(yán)重，AMI7天后有大量炎性細胞浸潤，AMI21天后有大量成纖維細胞增生。
　　3.透射電鏡觀察到，LAD結(jié)扎后小鼠心肌細胞內(nèi)肌原纖維溶解，殘存的線粒體聚集、密度增加、嵴模糊，線粒體膜破裂；自噬體體積增大，數(shù)量增多。
　　4.與Sham組相比，AMI7天小鼠梗死區(qū)、梗死周邊區(qū)和遠端區(qū)細胞

5、自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達水平?jīng)]有差異（P>0.05）。AMI21天后小鼠梗死區(qū)、梗死周邊區(qū)細胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達水平顯著增加（P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　LAD結(jié)扎后小鼠心臟功能障礙，并發(fā)生嚴(yán)重的心肌梗死；心臟超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，梗死心肌周邊區(qū)線粒體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、自噬體數(shù)量和體積增加；AMI21天自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ的表達水平升高；提示心梗模型建立成功，心梗周邊區(qū)自噬激活。
　　第二部分自噬增強對

6、小鼠急性心肌梗死的保護作用研究
　　目的：
　　第一部分我們已經(jīng)證實自噬在小鼠LAD結(jié)扎術(shù)后心肌梗死周邊區(qū)被明顯誘導(dǎo)，但是自噬在AMI中的作用仍存在爭執(zhí)。小鼠LAD結(jié)扎術(shù)后給予自噬激活劑Rapamycin及自噬抑制劑3-MA，探討自噬在AMI中的作用及其機制。
　　方法：
　　C57BL/6小鼠隨機分為3組：AMI組：LAD結(jié)扎+腹腔注射含0.25％Tween-80和0.03%無水乙醇的生理鹽水溶液，n=24；

7、Rapamycin組(RAPA組)：LAD結(jié)扎+Rapamycin（ip.2mg/kg/daily，n=24）；3-Methyladenine組（3-MA組）：LAD結(jié)扎+3-MA（ip.1.5mg/kg/daily，n=24）。從造模第二天開始每天給藥一次，連續(xù)給藥7天和21天。于實驗結(jié)束前一天用高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心臟功能；隨后處死小鼠取心臟分別進行以下實驗：TTC染色法檢測梗死面積的變化情況；HE染色法檢測心肌形態(tài)學(xué)

8、的變化情況；透射電子顯微鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu)的變化情況；Western-blot方法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B表達的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.與 AMI組相比，給藥7天、21天后 RAPA組小鼠心臟體重比值顯著降低（P<0.05），而3-MA組小鼠心臟體重比值變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。超聲心動圖結(jié)果顯示：與AMI組相比，給藥7天、21天后RAPA組小鼠LVIDs和LVIDd顯著性降低，LVEF、LVFS顯著性增加（

9、P<0.05）；而3-MA組小鼠LVIDs、LVIDd、LVEF和LVFS的變化均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　2. TTC染色結(jié)果顯示：與AMI組相比，給藥7天、21天后RAPA組小鼠左心室心肌梗死面積明顯降低（P<0.05）；而3-MA組小鼠左心室心肌梗死面積明顯增加（P>0.05）。HE染色結(jié)果顯示：與AMI組相比，給藥7天、21天后RAPA組小鼠心臟左心室前壁增厚，心肌細胞殘留較多，成纖維細胞增殖減輕；而3-MA組小

10、鼠心臟左心室前壁變薄，心肌細胞丟失增多，炎性細胞浸潤，心肌纖維化嚴(yán)重。
　　3.與AMI組相比，給藥7天、21天后RAPA組小鼠心肌細胞內(nèi)肌原纖維排列較整齊，線粒體結(jié)構(gòu)也較完整，自噬體體積增大，數(shù)量增多，內(nèi)含細胞質(zhì)和細胞器碎片。
　　4.與AMI組相比，給藥7天RAPA組小鼠細胞自噬蛋白LC3B-Ⅱ在梗死區(qū)的表達水平變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），而在梗死周邊區(qū)和遠端區(qū)的表達水平顯著增加（P<0.05）；給藥21天后RA

11、PA組小鼠梗死區(qū)和梗死周邊區(qū)細胞自噬蛋白 LC3B-Ⅱ表達水平顯著增加（P<0.05），而3-MA組小鼠梗死區(qū)和梗死周邊區(qū)細胞自噬蛋白LC3B-Ⅱ表達水平顯著降低（P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　給予Rapamycin明顯誘導(dǎo)自噬，改善AMI小鼠收縮功能障礙，并降低LAD結(jié)扎后心肌梗死面積，減少心梗周邊區(qū)心肌細胞丟失，改善心梗周邊區(qū)線粒體腫脹和結(jié)構(gòu)紊亂。給予3-MA明顯抑制自噬，對AMI小鼠收縮功能障礙無改善作用，并增加L