重組腺病毒Ad-hBNP對(duì)慢性心力衰竭大鼠治療作用的研究.pdf

1、目的： 本研究旨在探索BNP治療心力衰竭的新途徑。通過(guò)構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP，制備CHF大鼠模型，觀察外源基因hBNP導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體后在動(dòng)物體內(nèi)的分布及表達(dá)，探討B(tài)NP對(duì)CHF治療作用及其機(jī)制，為今后BNP基因治療的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究的理論依據(jù)。 方法： 1.構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP RT-PCR方法從人心肌組織獲得hBNP片段，與pUCm-T載體連接構(gòu)成pUC-hBNP重組質(zhì)粒；KpnⅠ、SalⅠ分別

2、雙酶切pUC-hBNP和pAdTrack-CMV，將目的片段插入pAdTrack-CMV構(gòu)建pAdTrack-hBNP重組質(zhì)粒；pAdTrack-hBNP重組質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ酶切線(xiàn)性化后，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架質(zhì)粒的E.coilBJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，同源重組獲得重組質(zhì)粒pAdEasy-hBNP；經(jīng)BamHⅠ、PacⅠ酶切鑒定及基因序列檢測(cè)后，重組成功的pAdEasy-hBNP經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)包裝、擴(kuò)增和純化后，

3、獲得可用于實(shí)驗(yàn)性基因治療的重組腺病毒Ad-hBNP。 2.制備CHF大鼠模型采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備CHF大鼠模型。于右腎動(dòng)脈分支處上方縮窄腹主動(dòng)脈至0.6mm，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組及正常對(duì)照組。12周后行超聲心動(dòng)圖及血液動(dòng)力學(xué)檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)和功能、放射免疫分析測(cè)定血清AgⅡ和Ald水平、HE染色及Masson染色檢測(cè)心肌病理學(xué)變化、RT-PCR分析心肌膠原mRNA表達(dá)，綜合評(píng)價(jià)CHF大鼠心功能。確定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)CHF大鼠入選標(biāo)準(zhǔn)。

4、 3.研究重組腺病毒Ad-hBNP對(duì)CHF大鼠的治療作用 （1）觀察CHF大鼠接受Ad-hBNP治療后，hBNP在體內(nèi)的分布與表達(dá)CHF大鼠24只，18只單次腹腔注射重組腺病毒Ad-hBNP后，隨機(jī)均分為1天組、4天組和7天組；另6只CHF大鼠不予以重組腺病毒，記為0點(diǎn)組。各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物于相應(yīng)的時(shí)間處死，ELISA檢測(cè)血清hBNP水平，免疫組化檢測(cè)CHF大鼠各臟器hBNP的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)各組織hBNP mRNA的表達(dá)。

5、 （2）觀察Ad-hBNP對(duì)CHF大鼠的治療效果30只CHF大鼠，隨機(jī)分為Ad-hBNP組、Ad-Track組、NS組，另設(shè)假手術(shù)組不予任何治療作為對(duì)照組，分別經(jīng)腹腔注射予以相應(yīng)治療，每周一次，共4周。4周后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行超聲心動(dòng)圖及血液動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，ELISA檢測(cè)血清hBNP水平，放射免疫分析測(cè)定血清AgⅡ、Ald、ET及TNF-α含量，RT-PCR分析心肌膠原mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.應(yīng)用Ad-Easy缺陷性腺病

6、毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP，純化后Ad-hBNP病毒滴度達(dá)到4.4275×1012VP/ml。透射電鏡觀察Ad-hBNP呈多面體結(jié)構(gòu)，顆粒直徑在90nm左右。 2.腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)12周后，經(jīng)超聲心動(dòng)圖和血液動(dòng)力學(xué)檢測(cè)、神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)、病理學(xué)及RT-PCR測(cè)定心肌膠原mRNA表達(dá)等多種途徑，并結(jié)合臨床表現(xiàn)綜合評(píng)價(jià)，證實(shí)CHF動(dòng)物模型造模成功。確定在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)CHF大鼠的入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）大鼠腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后12周，出

7、現(xiàn)進(jìn)食量減少，精神萎靡，少活動(dòng)，被毛無(wú)光澤、蓬松。（2）超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)：LVESD>0.32cm、VLEDD>0.65cm，EF<75%，F(xiàn)S<40%。 3.單次腹腔注射Ad-hBNP，CHF大鼠心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟及小腸均檢測(cè)到hBNP表達(dá)，外源性hBNP在CHF大鼠體內(nèi)的表達(dá)至少可持續(xù)7天。 4.間斷重組腺病毒Ad-hBNP治療，CHF大鼠IVS、LVEDD、LVESD、LVPW顯著降低，而EF、FS顯著

8、增高；同時(shí)CHF大鼠心功能明顯改善，表現(xiàn)為HR顯著降低，LVSP和+dP/dtmax顯著升高及LVEDP降低和-dP/dtmax絕對(duì)值升高。 5.與Ad-Track組及NS組比較，Ad-hBNP組血清AgⅡ、Ald、ET及TNF-α水平較明顯下降；心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)顯著降低。 結(jié)論： 1.應(yīng)用Ad-Easy缺陷性腺病毒載體系統(tǒng)可成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP。 2.利用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)可成功

9、制備CHF大鼠模型。 3.單次腹腔注射Ad-hBNP，外源hBNP基因可在CHF大鼠多臟器中得到有效表達(dá)，其生物學(xué)效應(yīng)時(shí)間顯著長(zhǎng)于BNP的生物半衰期。 4.間斷給予Ad-hBNP能夠有效地改善CHF大鼠心臟結(jié)構(gòu)、功能及心室重構(gòu)。BNP可能在抑制循環(huán)或局部神經(jīng)內(nèi)分泌-細(xì)胞因子水平發(fā)揮作用，對(duì)抗心室重構(gòu)。 應(yīng)用BNP治療CHF是否有益目前尚存爭(zhēng)議，本研究就此問(wèn)題得出了初步結(jié)果，認(rèn)為BNP基因治療心力衰竭是一種新的嘗試