攜HBV PreS1重組腺病毒基因治療載體對肝細(xì)胞嗜向性的研究.pdf

1、目的:擴(kuò)增純化鑒定重組腺病毒基因治療載體rAd-preS1，體外多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測其對肝細(xì)胞的嗜向性。
　　方法:同源重組法構(gòu)建了含HBV嗜肝性基因PreS1的重組腺病毒質(zhì)粒prAd-PreS1，酶切鑒定后293細(xì)胞包裝生成腺病毒rAd-preS1。聚合酶鏈反應(yīng)PCR檢測目的基因片段Pres1。經(jīng)反復(fù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增獲得較高滴度重組腺病毒，氯化銫經(jīng)典法純化病毒。用rAd-preS1體外分別感染人正常肝細(xì)胞(L02)、人肺癌細(xì)胞(A

2、549)、人喉癌細(xì)胞（Hep2）檢測其肝嗜向性，同時(shí)野生腺病毒rAd作為對照，觀察各細(xì)胞中熒光蛋白GFP表達(dá)情況，比較各細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度值，同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各細(xì)胞重組腺病毒的感染率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:酶切鑒定證實(shí)rAd-preS1載體構(gòu)建成功，擴(kuò)增后病毒滴度1.15×109efu/ml。PCR結(jié)果示大小750bp目的基因片段。rAd-preS1轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞示L02細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于A549、Hep2細(xì)胞

3、，L02細(xì)胞的病毒滴度值高于A549、Hep2，有顯著差異（P值均＜0.01），而A549、Hep2細(xì)胞間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值＞0.05）;對照組各細(xì)胞間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值＞0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示人肝細(xì)胞感染率顯著高于非肝細(xì)胞組。
　　結(jié)論:攜HBV PreS1重組腺病毒載體rAd-preS1對人肝細(xì)胞相對較強(qiáng)嗜向性，而對非肝細(xì)胞無明顯效果，野生腺病毒無明顯細(xì)胞嗜向性，為進(jìn)一步研究肝臟疾病靶向基因治療奠定了基礎(chǔ)