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文檔簡介
1、背景: 乙肝病毒(HBV)感染仍然是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病,全球大約有20億人曾經(jīng)感染過乙肝病毒,其中超過3.5億人成為慢性感染者,每年可導(dǎo)致120萬患者死亡,而且每年有32萬患者死于HBV感染導(dǎo)致的肝癌。我國屬于肝炎高發(fā)區(qū),現(xiàn)患乙型肝炎為2800萬。 乙肝患者中25%~40%最終將死于肝硬化和肝癌,失代償性肝硬化的5年生存率約為15%,對于重癥肝病的治療,以保守治療為主,不能解決根本問題,最終只能寄希望于原位
2、肝移植。 由于健康供體肝臟的嚴(yán)重短缺且費(fèi)用昂貴,僅有少數(shù)需要肝移植的患者可以接受原位移植治療。肝細(xì)胞移植技術(shù)為解決這一矛盾提供了新的思路和方法,同時也可能更適合我國大量患者的經(jīng)濟(jì)承受能力。肝細(xì)胞移植治療重癥肝病,具有創(chuàng)傷性小、費(fèi)用低廉、安全性高,免疫原性小,而且一個供體可以為多個受體提供細(xì)胞來源。經(jīng)過多年的基礎(chǔ)研究,肝細(xì)胞移植已經(jīng)初步應(yīng)用于臨床,目前已有多位患者接受了同種異體肝細(xì)胞移植或自體肝細(xì)胞移植(應(yīng)用或不應(yīng)用基因修飾),證
3、實(shí)肝細(xì)胞移植對于治療肝臟遺傳性疾病及各種原因引起的肝衰竭有應(yīng)用價值。 目前用于臨床肝細(xì)胞移植的細(xì)胞主要來源包括:成體肝細(xì)胞、胎肝細(xì)胞。處于臨床前研究階段的細(xì)胞來源包括:異種肝細(xì)胞、肝前體/干細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞、基因修飾自體肝細(xì)胞移植等。 本文主要探討胎肝細(xì)胞的長期培養(yǎng)及重組1.3拷貝HBV腺病毒感染人胎肝細(xì)胞。 目的: 1、為肝細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用及科研提供可靠的細(xì)胞來源。 2、建立長期培養(yǎng)胎肝細(xì)胞
4、的平臺,為進(jìn)一步研究胎肝細(xì)胞做基礎(chǔ)。 3、建立重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞的體外模型,觀察了解HBV在胎肝細(xì)胞中的復(fù)制表達(dá)情況。 1、材料與方法: 1、胎肝細(xì)胞的分離1.1 胎肝來源于南方醫(yī)院婦產(chǎn)科流產(chǎn)胎兒。 1.2 采用改良兩步膠原酶灌注法,經(jīng)臍靜脈灌注胎肝分離胎肝細(xì)胞。 2、胎肝細(xì)胞的凍存:胎肝細(xì)胞的保存:凍存細(xì)胞密度為5-7×10<'6>/mL;凍存液由RPMI1640基培:人AB
5、血清:DMSO終濃度比例為6:3:1構(gòu)成;采用階段降溫法,即4℃、60分;-20℃、30分;-80℃、18小時;最后置于液氮中保存。 3、胎肝細(xì)胞的復(fù)蘇:采用常規(guī)快速復(fù)溫法,液氮中取出凍存管,迅速投入37~38℃水浴中,1分鐘快速融化。 4、長期培養(yǎng)胎肝細(xì)胞方法的建立:胎肝細(xì)胞在用血清培養(yǎng)基貼壁生長4小時后,Ham's F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞,以去除培養(yǎng)液中胎牛血清、造血細(xì)胞及未貼壁的胎肝細(xì)胞。更換用Ham'sFl2基
6、礎(chǔ)培養(yǎng)基做母液,其中添加地塞米松、胰島素、胰高血糖素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子和生長激素等配制成不含血清的條件培養(yǎng)基,每2天更換一次新鮮配制的條件培養(yǎng)基,5、重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞5.1 重組1.3拷貝HBV腺病毒:本室保存。 5.2 胎肝細(xì)胞:我科分離凍存的胎肝細(xì)胞,細(xì)胞活力為84%。 5.3重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞,孵育2小時后,洗滌細(xì)胞10次,細(xì)胞培養(yǎng)7天后收集上清,培養(yǎng)上清中HBsAg
7、、HBeAg的表達(dá)水平用雅培全自動微粒子酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行檢測;上清中HBV DNA載量采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測;胎肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg及HBcAg的檢測用常規(guī)免疫組化法。結(jié)果: 1、采用兩步膠原酶灌注方法,在4℃條件下,在分離后的0、30、54、104、126小時,胎肝的活力分別為83%、78%、70%、65%、0%。應(yīng)用10%DMSO凍存胎肝細(xì)胞,1周、2周、2月后復(fù)蘇胎肝細(xì)胞,活力分別為84.17%、82%、84%。用倒
8、置相差生物顯微鏡對培養(yǎng)胎肝細(xì)胞進(jìn)行觀察顯示:胎肝細(xì)胞接種后2-3小時開始貼壁、伸展,約6小時后完成貼壁過程;24小時后細(xì)胞由圓球形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則多邊形,細(xì)胞核清晰可見,細(xì)胞相互連接,部分肝細(xì)胞呈雙核;用不含血清的條件培養(yǎng)基在培養(yǎng)3天后肝細(xì)胞間相互接觸、滿布培養(yǎng)瓶,在培養(yǎng)的lO天、15天、30天及45天,倒置相差生物顯微鏡觀察仍清晰可見形態(tài)規(guī)則的單核細(xì)胞以及正在分裂的雙核細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測胎肝細(xì)胞高表達(dá)CD90及CD34表面標(biāo)記物,美
9、國雅培全自動微粒子酶聯(lián)免疫分析法檢測到特異性AFP。 2、重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞2小時后,洗滌lO遍后,培養(yǎng)7天后,上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA定量顯著增加,常規(guī)細(xì)胞免疫組化可檢測到胎肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg及HBcAg的表達(dá)。 結(jié)論: 1、經(jīng)臍靜脈插管兩步法分離胎肝細(xì)胞是一種有效簡易的方法。 2、分離凍存的胎肝細(xì)胞可為臨床及科研提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 3、采用條件培養(yǎng)基可
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