力達霉素及其聯(lián)合bortezomib抗骨髓瘤的分子機制研究.pdf

1、力達霉素(Lidamycin，LDM)是本研究所從一株放線菌(Streptomyces globisporusC—1027)代謝產(chǎn)物中獲得的對多種腫瘤細胞有強烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素，大量研究表明，LDM對多種腫瘤細胞及移植瘤具有極強的抗腫瘤活性，這都源于LDM對DNA的強烈地切割作用。最近研究顯示LDM可引起腫瘤細胞染色體畸變及端粒功能異常。目前，LDM正作為一種新的化療藥物進行臨床Ⅱ期試驗研究。本課題選用一種小鼠骨髓瘤細胞

2、株：SP2/0和2種人多發(fā)性骨髓瘤細胞株：U266和SKO-007，探討LDM體內(nèi)體外對鼠骨髓瘤和人多發(fā)性骨髓瘤的影響及其作用機制。此外本課題還初步研究了LDM聯(lián)合bortezomib對人多發(fā)性骨髓瘤細胞U266和SKO-007的影響，從而為LDM聯(lián)合bortezomib的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 1.LDM抗鼠骨髓瘤作用的分子機制研究。 1.1 LDM作用于小鼠骨髓瘤細胞的體外實驗研究。 1.1.1 MTS結(jié)果顯示L

3、DM顯著抑制鼠骨髓瘤SP2/0細胞的增殖。 1.1.2 LDM對鼠骨髓瘤SP2/0細胞形態(tài)的影響。 1.1.3 Hoechst33342熒光染色法和FITC—Annexin Ⅴ/PI雙染結(jié)合流式細胞儀檢測LDM對SP2/0細胞凋亡的誘導作用。 1.1.4 PI單染結(jié)合流式細胞儀檢測LDM對SP2/0細胞周期分布的影響。 1.1.5 Western blot法檢測了LDM對細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的影響。

4、 1.1.6 Western blot法檢測了LDM對對絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen—activated protein kinases，MAPKs)信號通路分子的表達影響。 1.1.7 分別應(yīng)用JNK抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB203580)和MEK抑制劑(U0126)預(yù)處理SP2/0細胞2h，再加入LDM(0.001nM，0.01nM，0.1nM，和1nM)繼續(xù)作用48h，MTS結(jié)果顯示單獨的3種

5、抑制劑對細胞的增殖抑制作用均不明顯，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對SP2/0的細胞毒作用，提示JNK和p38MAPK的激活參與了LDM對SP2/0細胞的增殖抑制作用，而U0126與LDM合用后提高了LDM對SP2/0的細胞毒作用，提示ERK的激活有利于SP2/0細胞的生存。 1.1.8 SP600125預(yù)處理SP2/0細胞2h，再加入LDM(0.5nM)繼續(xù)作用48h，Westernblo

6、t結(jié)果顯示SP600125可消除LDM引起的JNK的活化，同時也消除了LDM引起的caspase—3和caspase—7的激活及PARP的切割。 1.2 LDM作用于小鼠骨髓瘤的體內(nèi)實驗研究。 2.LDM抗人多發(fā)性骨髓瘤細胞的作用及其分子機制研究。 2.1 LDM作用于人多發(fā)性骨髓瘤的體外實驗研究。 2.1.1 MTS結(jié)果顯示LDM顯著抑制人MM細胞(U266和SKO-007)的增殖。 2.1.2

7、 LDM對人MM細胞形態(tài)的影響。 2.1.3 Hoechst33342熒光染色法和FITC—AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細胞儀檢測LDM對U266和SKO-007細胞凋亡的誘導作用。 2.1.4 PI單染結(jié)合流式細胞儀檢測LDM對U266和SKO-007細胞周期分布的影響。 2.1.5 利用Transwell實驗觀察LDM對U266和SKO-007細胞遷移能力的影響。 2.1.6 Westernbl

8、ot法測定了LDM對侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)靶點分子的影響。 2.1.7 應(yīng)用Westernblot法測定了LDM對凋亡相關(guān)蛋白及細胞周期蛋白的表達的影響。 2.1.8 應(yīng)用Westernblot法測定了LDM對MAPKs信號通路分子的表達影響。 2.1.9 為研究JNK、ERK和p38MAPK的激活在LDM增殖抑制中的作用，分別應(yīng)用SP600125、SB203580和U0126預(yù)處理U266細胞2h，再加入LDM(0.0

9、01nM，0.01nM，0.1nM，和1nMLDM)繼續(xù)作用48h，MTS結(jié)果顯示3種抑制劑單獨對細胞的增殖抑制作用均不明顯，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對U266的細胞毒作用，而U0126與LDM合用后提高了LDM對U266的細胞毒作用。在SKO-007細胞觀察到同樣的結(jié)果。 2.1.10 為了探討MAPKs的激活在LDM誘導凋亡中的作用，分別用SP600125、SB203580和U01

10、26預(yù)處理U266細胞2h，再加入LDM(0.5nM或1nMLDM)繼續(xù)作用48h，F(xiàn)ITC—AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細胞儀檢測結(jié)果顯示單獨的3種抑制劑對細胞的凋亡誘導作用均不明顯，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對U266的細胞凋亡誘導作用，而U0126與LDM合用后則提高了LDM對U266的細胞凋亡誘導作用。在SKO-007細胞觀察到同樣的結(jié)果。 2.1.11 為了探討JNK、p

11、38MAPK的激活在LDM誘導凋亡中的作用機制，分別用SP600125和SB203580預(yù)處理U266細胞2h，再加入LDM(0.5nM)繼續(xù)作用48h，Westernblot檢測結(jié)果顯示單獨的兩種抑制劑對細胞的凋亡相關(guān)蛋白的表達影響不大，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對PARP和aspase3/7的激活。在SKO-007細胞觀察到同樣的結(jié)果。 2.1.12 應(yīng)用Westernblot法測定

12、了LDM對NF—κB及IκBα表達的影響。結(jié)果顯示LDM劑量依賴性地誘導兩種人多發(fā)性骨髓瘤細胞IκBα的磷酸化，但對總IκBα的表達無影響，在LDM的作用下，U266的NF—κB的表達濃度依賴性的降低，而SKO-007濃度依賴性的升高。 2.2 LDM對蛋白酶體活性的影響。 檢測了不同劑量的LDM作用于高純化的20S蛋白酶體對其胰凝乳蛋白酶樣活性的影響，發(fā)現(xiàn)所用的劑量(0.1nM、0.5nM、1nM和2nM)LDM對胰凝

13、乳蛋白酶樣活性沒有明顯的影響，不同劑量的LDM作用于MM細胞48h，提取26S蛋白酶體，定量后檢測胰凝乳蛋白酶樣活性結(jié)果同上?？梢奓DM發(fā)揮強大的凋亡誘導作用，并不是通過對蛋白酶體活性抑制實現(xiàn)的。同時發(fā)現(xiàn)大劑量的LDM(100nM、1000nM和10，000nM)具有激活胰凝乳蛋白酶樣活性的作用。 3.LDM聯(lián)合bortezomib作用于人多發(fā)性骨髓瘤的的體外實驗研究。 3.1 LDM聯(lián)合bortezomib抗多發(fā)性骨髓

14、瘤的協(xié)同作用。 3.1.1 MTS結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合作用時，能夠明顯抑制細胞增殖，其CDI<1，具有協(xié)同抗腫瘤作用。 3.1.2 FITC—AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細胞儀檢測結(jié)果顯示聯(lián)合用藥可明顯增強單藥的凋亡誘導率。低聯(lián)合濃度(0.5nM的LDM與5nM的bortezomib)對U266細胞的凋亡誘導率為22.91％，明顯高于兩藥單用誘導的凋亡率15.07％及3.90％，較高聯(lián)合濃度(0.5nM的LDM與10

15、nM的bortezomib)對U266細胞的凋亡誘導率為67.11％，明顯高于兩藥單用誘導的凋亡率15.07％及5.91％，在SKO-007細胞觀察到同樣的結(jié)果。 3.2 LDM聯(lián)合bortezomib協(xié)同抗多發(fā)性骨髓瘤的作用機制。 3.2.1 Westernblot結(jié)果顯示LDM聯(lián)合bortezomib后可使PARP和caspase—3的切割顯著增強，進一步上調(diào)了p21的表達。聯(lián)合用藥還降低NF—κB的水平。

16、3.2.2 Westernblot法測定了單藥及聯(lián)合用藥對MAPKs的表達影響，結(jié)果顯示，bortezomib呈劑量依賴性地激活JNK和p38MAPK。兩藥聯(lián)合后可使JNK和p38MAPK的激活顯著增強。相反，兩藥聯(lián)合后可使ERK的激活顯著降低。 綜上，研究表明LDM能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的鼠骨髓瘤和人多發(fā)性骨髓瘤的細胞的增殖，比其他常規(guī)化療藥細胞毒作用更大。并通過激活JNK和p38MAPK誘導細胞凋亡，降低腫瘤細胞VEGF和MM