cAMP在小劑量環(huán)磷酰胺逆轉(zhuǎn)NHL動物模型免疫逃逸過程中的作用研究.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)是來源于B、T淋巴細胞的免疫系統(tǒng)惡性腫瘤，在NHL發(fā)生發(fā)展過程中，淋巴瘤細胞通過多種免疫機制以逃避機體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)在淋巴瘤的免疫逃逸和免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。許多研究致力于減少Tregs數(shù)量及/或功能，提高效應(yīng)T細胞(effector T cells，Teff)的功能，從而阻斷淋巴瘤免疫耐受形成的

2、關(guān)鍵通路，期望對NHL免疫療法起到關(guān)鍵性的輔助作用。Bopp T等的研究發(fā)現(xiàn)Tregs可以通過細胞間的縫隙連接將環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)轉(zhuǎn)運至Teff胞內(nèi)，從而提高了Teff細胞內(nèi)cAMP含量，抑制了白介素2的合成。提示免疫細胞內(nèi)的cAMP含量與Tregs介導(dǎo)的免疫逃逸過程有著密切關(guān)系。
　　 近年來研究證實，小劑量環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CY)在腫

3、瘤及自身免疫病的治療中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CY是細胞毒類烷化劑，廣泛應(yīng)用于淋巴瘤化療中，但是尚無小劑量環(huán)磷酰胺在淋巴瘤動物模型中免疫調(diào)節(jié)機制的相關(guān)研究。本研究中我們將小劑量CY應(yīng)用于NHL動物模型中，探討了CY對Tregs細胞的作用機制。本研究為創(chuàng)新性研究。
　　 在淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)展的過程中涉及多種信號途徑，細胞是存活還是凋亡取決于細胞內(nèi)及細胞間多種信號途徑之間的平衡網(wǎng)絡(luò)。其中cAMP信號途徑在淋巴瘤細胞凋亡過程中的作用日益受

4、到重視，提高淋巴瘤細胞內(nèi)的cAMP濃度有助于促進惡性淋巴細胞的凋亡，從而達到靶向治療的目的。
　　 本研究通過應(yīng)用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、動物實驗以及免疫學(xué)技術(shù)，闡明了cAMP信號途徑在小劑量環(huán)磷酰胺逆轉(zhuǎn)NHL動物模型中免疫逃逸過程的作用。同時對小劑量環(huán)磷酰胺和cAMP擬似物的協(xié)同作用進行了初步探討。尋求淋巴瘤免疫治療的新方法，提高臨床治療效果。
　　 第一部分：小劑量環(huán)磷酰胺逆轉(zhuǎn)NHL動物模型免疫逃逸過程的作用研究

5、r>　　 目的：本研究中，為了研究小劑量環(huán)磷酰胺(20mg/kg)對Tregs的抑制作用，我們選用小鼠B細胞淋巴瘤細胞株A20細胞建立侵襲性淋巴瘤小鼠模型。首先比較了治療前后各組小鼠的荷瘤生存期及腫瘤直徑變化。并進一步制備引流淋巴結(jié)的單細胞懸液，通過磁珠分選，獲得純化的Tregs和Teff細胞。檢測免疫細胞的Foxp3及IL-2表達等指標(biāo)，觀察小劑量CY治療前后Tregs和效應(yīng)T細胞的功能變化。
　　 材料與方法：
　　

6、 1.細胞培養(yǎng)和動物實驗
　　 2.單細胞制備
　　 3.蛋白提取及蛋白印記分析
　　 4.提取RNA，進行RT-PCR
　　 5.Tregs及效應(yīng)T細胞(Teft)的分離
　　 6.流式細胞儀分析
　　 7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 結(jié)果：
　　 1.A20細胞培養(yǎng)及小鼠模型的建立(圖1)
　　 (1)小鼠B系淋巴瘤細胞株A20由中山大學(xué)腫瘤研究所饋贈，應(yīng)用含10％滅活

7、的胎牛血清、青霉素(100U/ml)以及鏈霉素(100mg/mL)的RPMI-1640(Gibco)全培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。每2-3天傳代一次。所有實驗均選用對數(shù)生長期的細胞。
　　 (2)制備A20細胞懸液：在A20細胞株處于對數(shù)期生長的情況下，使用不含血清的1640培養(yǎng)基洗凈細胞，離心，170g，10min，調(diào)整密度至5×107/mL。
　　 (3)選取6-8周齡BALB/c近交系小鼠，在右背部皮下

8、注射A20細胞懸液100μL。正常組以PBS溶液代替A20細胞懸液。腫瘤植入后7天，給予20mg/kg CY。
　　 2.BALB/c小鼠NHL模型的觀察
　　 對接種A20細胞的小鼠的成瘤情況進行觀察，成瘤率為90％。
　　 皮下注射A20細胞懸液后7天、14天、21天、28天分別測量兩組荷瘤小鼠的腫瘤直徑，CY治療后腫瘤直徑明顯縮小，生存期延長，延緩了腫瘤發(fā)展(圖2A和B)。
　　 3.流式細胞術(shù)檢測

9、
　　 3.1荷瘤小鼠引流淋巴結(jié)內(nèi)CD+CD25+T細胞比值變化
　　 在荷瘤小鼠的引流淋巴結(jié)內(nèi)，CD4+CD25+T細胞占淋巴細胞的比例腫瘤組明顯高于正常對照組，CY治療后下降，8天達到最低點，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.0004)(圖3)。
　　 3.2 MACS提取CD4+CD25-T細胞，CD4+CD25+T細胞的純度測定
　　 通過流式細胞術(shù)證實，使用MACS技術(shù)分離后得到的CD4+CD25-T細

10、胞純度在98％以上，CD4+CD25+T細胞純度在90％以上。
　　 4.實時定量RT-PCR檢測Foxp3表達
　　 Foxp3mRNA表達量在荷瘤小鼠引流淋巴結(jié)中表達高于對照組。CY治療可以明顯降低Foxp3表達，在治療8天時達到抑制最低點，后Foxp3表達逐漸恢復(fù)至治療前(圖4)。
　　 5.Western Blot技術(shù)檢測各類T細胞內(nèi)FoxP3蛋白的表達
　　 MACS技術(shù)分離得到的淋巴結(jié)內(nèi)CD4

11、+CD25+T細胞，可見到FoxP3蛋白表達。經(jīng)小劑量CY治療后Foxp3蛋白表達量隨著時間有變化。第8天最低，第14天恢復(fù)(圖5)。
　　 6.實時熒光定量PCR檢測IL-2表達
　　 BALB/c小鼠IL-2mRNA表達量顯著高于荷瘤組。隨著CY作用時間不同，IL-2表達量顯示出先升高后降低的趨勢，CY治療第8天達到最高水平，與荷瘤小鼠比較有顯著差異(圖6)。
　　 結(jié)論：
　　 1.A20 B細胞淋

12、巴瘤小鼠模型是一種良好的NHL動物模型。
　　 2.Tregs在淋巴瘤動物模型中高表達，與腫瘤免疫耐受相關(guān)。
　　 3.小劑量環(huán)磷酰胺可短暫下調(diào)動物模型中Tregs比例及功能，刺激效應(yīng)T細胞功能，有望逆轉(zhuǎn)免疫耐受。
　　 4.小劑量環(huán)磷酰胺延長動物模型的荷瘤生存期，是通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。
　　 第二部分：cAMP在小劑量CY抑制Tregs過程中的作用研究和cAMP擬似物對NHL細胞凋亡作用的研究

13、　　 目的：淋巴瘤小鼠模型中小劑量CY發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，在本部分，我們進一步研究了免疫細胞內(nèi)cAMP含量在CY作用過程中的變化，以明確CY的作用機制，為cAMP信號途徑與環(huán)磷酰胺途徑的協(xié)同作用奠定理論基礎(chǔ)。腫瘤細胞是存活還是凋亡取決于細胞內(nèi)及細胞間多種信號途徑之間的平衡網(wǎng)絡(luò)。其中cAMP信號途徑在淋巴瘤細胞凋亡過程中的作用日益受到重視。本研究中，我們將臨床常用的cAMP擬似物作用于A20淋巴瘤細胞株，并研究了CY和cAMP擬似物對動

14、物模型的腫瘤組織中磷酸化及未磷酸化AKT的變化，探討淋巴瘤細胞的凋亡機制，從而達到靶向治療的目的。
　　 材料與方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)及動物實驗
　　 2.免疫細胞內(nèi)cAMP含量測定
　　 3.腫瘤組織蛋白提取及蛋白印記分析
　　 4.流式細胞儀檢測A20細胞凋亡及周期阻滯
　　 5.免疫組化研究
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 結(jié)果：
　　 1.不同免疫細胞內(nèi)cA

15、MP含量變化
　　 我們檢測了小劑量CY治療前后免疫細胞內(nèi)的cAMP含量變化。明確cAMP信號途徑在小劑量環(huán)磷酰胺作用過程中的重要作用。
　　 1.1CD4+CD25-T細胞內(nèi)cAMP含量變化：
　　 BALB/c小鼠Teff細胞內(nèi)較荷瘤小鼠低，CY治療4天后細胞內(nèi)cAMP含量逐漸降低，第8天降至最低，治療14天時再次升高。CY治療第8天與治療14天比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 1.2 CD4+CD25

16、+T細胞內(nèi)cAMP含量變化：
　　 荷瘤小鼠較BALB/c小鼠Tregs細胞內(nèi)含量高，CY治療4天后細胞內(nèi)cAMP含量逐漸降低至第8天最低，治療14天時再次升高。CY8天與14天比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖8)。
　　 2.A20細胞株凋亡
　　 在不同濃度的cAMP擬似物誘導(dǎo)下，A20細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，周期阻滯不明顯。
　　 3.腫瘤組織中AKT磷酸化及未磷酸化形式的蛋白含量改變
　　 小劑

17、量CY對NHL動物模型中的腫瘤組織AKT形式磷酸化沒有影響。而cAMP擬似物可以抑制磷酸化AKT的表達。
　　 4.免疫組化結(jié)果
　　 小劑量CY對NHL動物模型中的腫瘤組織AKT形式磷酸化沒有影響。而cAMP擬似物可以抑制磷酸化AKT的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.cAMP擬似物誘導(dǎo)淋巴瘤細胞株凋亡。
　　 2.小劑量CY對NHL動物模型中的腫瘤組織AKT形式磷酸化沒有影響。
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