腹腔預(yù)處理去細(xì)胞光氧化豬主動(dòng)脈瓣膜制備組織工程瓣膜.pdf

1、第一部分去細(xì)胞結(jié)合光氧化對(duì)豬主動(dòng)脈瓣膜組織學(xué)和生物力學(xué)的影響。
　　 目的：采用去細(xì)胞結(jié)合染料介導(dǎo)的光氧化法處理豬主動(dòng)脈瓣膜，尋找合適去細(xì)胞方案；評(píng)價(jià)光氧化交聯(lián)法對(duì)豬主動(dòng)脈瓣膜的生物力學(xué)性能的影響。
　　 方法：
　　 體外性能的研究：將120個(gè)瓣膜隨機(jī)分為12組，每組10個(gè)，通過(guò)對(duì)瓣膜多步驟的去細(xì)胞效果，以及膠原彈力纖維保存的完整性等方面評(píng)價(jià)，獲得去細(xì)胞的合適方案；將修剪好的40去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜隨機(jī)分為4組，

2、每組10個(gè)。F組：為新鮮組，置于無(wú)菌PBS液中40℃保存?zhèn)溆?。DP組：為去細(xì)胞結(jié)合光氧化處理組，共計(jì)三個(gè)亞組：DP12h組：為去細(xì)胞處理后再進(jìn)行染料介導(dǎo)的光氧化處理12小時(shí)；DP24h組：去細(xì)胞后光氧化反應(yīng)24小時(shí)；DP36h組：去細(xì)胞后光氧化反應(yīng)36小時(shí)。通過(guò)熱皺縮溫度、組織含水量、最大抗張強(qiáng)度和最大拉伸距離及體外酶降解實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)光氧化的最理想時(shí)間。
　　 體內(nèi)性能研究：得到合適去細(xì)胞光氧化方案后，將45個(gè)瓣膜分為3組，新鮮組、

3、戊二醛組、去細(xì)胞光氧化組。通過(guò)熱皺縮溫度、塌大抗張強(qiáng)度和最大拉伸距離評(píng)價(jià)各瓣膜性能。然后建立大鼠皮下包埋模型，12周后獲取組織標(biāo)本，通過(guò)HE染色，比較各組瓣葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及炎性反應(yīng)情況；原子吸收光譜法測(cè)定組織鈣含量，評(píng)價(jià)光氧化處理對(duì)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的體內(nèi)生物穩(wěn)定性及抗鈣化性能影響。
　　 結(jié)果：
　　 采用多步驟去垢劑-酶消化法處理豬主動(dòng)脈瓣膜，能夠有效的去除瓣膜的細(xì)胞成分同時(shí)保留了完整的細(xì)胞外基質(zhì)成分。第Ⅷ組脫細(xì)胞

4、處理后的豬瓣膜比較理想，組織大體形態(tài)和新鮮豬瓣膜相似，光鏡觀察結(jié)果顯示：細(xì)胞成分去除徹底，未見(jiàn)明顯細(xì)胞殘留成分，膠原彈力纖維保存較完整，組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯疏松。
　　 光鏡結(jié)果顯示，經(jīng)光氧化反應(yīng)進(jìn)一步交聯(lián)后去細(xì)胞瓣膜的組織結(jié)構(gòu)將變緊湊，24小時(shí)可達(dá)最佳效果。機(jī)械性能檢測(cè)顯示，光氧化交聯(lián)去細(xì)胞后的瓣膜，其機(jī)械性能將逐漸恢復(fù)，至光氧化24小時(shí)后去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的機(jī)械性能與新鮮組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；體外抗酶降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

5、，去細(xì)胞光氧化后的豬主動(dòng)脈瓣膜抗酶解能力相比新鮮的豬主動(dòng)脈瓣膜有所提高，光氧化處理24小時(shí)后的抗酶解能力要優(yōu)于12小時(shí)，與再處理12小時(shí)的效果無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 體內(nèi)性能研究結(jié)果顯示，大鼠皮下包埋實(shí)驗(yàn)中，新鮮對(duì)照組的豬主動(dòng)脈瓣膜發(fā)生了比較嚴(yán)重、廣泛的炎性反應(yīng)，并出現(xiàn)了一定程度的溶解；去細(xì)胞光氧化組的炎性反應(yīng)是所有組別中最輕的。鈣含量測(cè)定結(jié)果顯示去細(xì)胞光氧化組鈣化程度最低，與其它兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；去

6、細(xì)胞光氧化組的生物穩(wěn)定性要優(yōu)于新鮮的豬主動(dòng)脈瓣膜及戊二醛組，瓣葉無(wú)明顯降解，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少且范圍局限，組織結(jié)構(gòu)保存較好并有新生血管形成。戊二醛處理組可見(jiàn)明顯大片團(tuán)聚鈣化區(qū)域，鈣含量測(cè)定結(jié)果與其它兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用多步驟去垢劑一酶消化法(0.25％曲那通X-10024h，0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA10min，30u/mlDNase-I和0.3mg/mlRNase

7、-A12h)是適合豬主動(dòng)脈瓣膜的較佳脫細(xì)胞方案，能夠有效去除其細(xì)胞成分，同時(shí)完整保存膠原纖維及彈力纖維。
　　 2.光氧化反應(yīng)對(duì)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的交聯(lián)作用呈時(shí)間依賴性，至光氧化反應(yīng)24小時(shí)性能表現(xiàn)最佳。
　　 3.相比新鮮豬主動(dòng)脈瓣膜，去細(xì)胞光氧化反應(yīng)交聯(lián)的豬主動(dòng)脈瓣膜脈免疫原性低，生物耐受程度好。而相對(duì)戊二醛處理的豬主動(dòng)脈瓣膜則具有更好的抗鈣化性能。
　　 4.去細(xì)胞結(jié)合光氧化處理有可能成為前景廣泛、適合于處

8、理豬主動(dòng)脈瓣膜新型處理方法。
　　 第二部分腹腔預(yù)處理制備組織工程瓣膜。
　　 目的：評(píng)價(jià)腹腔預(yù)處理的去細(xì)胞光氧化的豬主動(dòng)脈瓣膜在體內(nèi)生物學(xué)性能及抗栓性能，細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　 方法：
　　 成年狗10只，雌雄不拘，隨機(jī)分為兩組，一組為腹腔預(yù)處理組，一組為普通組。去細(xì)胞光氧化的豬主動(dòng)脈瓣膜，植入狗的腹腔內(nèi)5天，然后取出裁剪成帶瓣血管片，吻合到同一只狗的腹主動(dòng)脈上，2月后取出，普通組是將去細(xì)胞光氧化的豬主動(dòng)

9、脈瓣膜裁剪成帶瓣血管片直接吻合到狗的腹主動(dòng)脈上，2月后取出。觀察其細(xì)胞生成情況，Ⅷ因子染色和α-SMA免疫組化染色觀察其內(nèi)皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，通過(guò)熱皺縮溫度、最大抗張強(qiáng)度和最大拉伸距離評(píng)價(jià)其機(jī)械性能。
　　 結(jié)果：
　　 兩組狗術(shù)后均無(wú)死亡，大體觀察兩組帶瓣血管片光滑，無(wú)血栓形成。
　　 Ⅷ因子染色和α-SMA染色顯示預(yù)處理組的帶瓣血管片上有大量的肌成纖維細(xì)胞生成，表面有單層排列的內(nèi)皮細(xì)胞，普通組有少

10、量的肌成纖維細(xì)胞和散在的內(nèi)皮細(xì)胞生成。機(jī)械性能研究顯示腹腔預(yù)處理組的帶瓣血管片熱皺縮溫度、最大抗張強(qiáng)度和最大拉伸距離明顯強(qiáng)于普通組的帶瓣血管片p<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 去細(xì)胞結(jié)合光氧化反應(yīng)處理的豬主動(dòng)脈瓣膜植入體內(nèi)后無(wú)不良反應(yīng)，生物穩(wěn)定性好，無(wú)血栓形成
　　 腹腔預(yù)處理制備的組織工程瓣膜體內(nèi)能夠再細(xì)胞化，其機(jī)械性能保持好，抗栓性能好。
　　 腹腔預(yù)處理方法有望成為構(gòu)建組織工程瓣膜的新途徑。