一 脫細(xì)胞牛心包羊肺動(dòng)脈補(bǔ)片實(shí)驗(yàn)研究;二 人腹主動(dòng)脈預(yù)處理為組織工程血管研究.pdf

1、一、脫細(xì)胞牛心包羊肺動(dòng)脈補(bǔ)片實(shí)驗(yàn)研究 背景：目前治療心血管疾患使用的替代材料存在一定的局限性，缺乏抗感染、抗血栓、抗鈣化能力及潛在的生長(zhǎng)重塑能力，最終導(dǎo)致移植物衰竭。組織工程為組織修復(fù)和重建提供了解決方案，它應(yīng)用工程學(xué)、材料科學(xué)及生物學(xué)的原理，開(kāi)發(fā)能夠維持、修復(fù)或改善組織功能的生物替代物以用于臨床，并在心血管組織工程方面取得了一些進(jìn)展。 目的：采用酶-去污劑聯(lián)合脫細(xì)胞處理牛心包作為支架材料，體外進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試和植入小鼠

2、體內(nèi)評(píng)價(jià)生物相容性和鈣化情況，同時(shí)分離羊頸靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增鑒定并分層種植到脫細(xì)胞牛心包，構(gòu)建有生物活性的組織工程血管補(bǔ)片，植入到羊肺動(dòng)脈后觀察不同時(shí)期的組織再生和重建情況。 材料與方法：新鮮牛心包按照不同的處理方法隨機(jī)分為三組，A、新鮮牛心包組；B、戊二醛處理組：新鮮牛心包采用0.5％的戊二醛進(jìn)行處理；C、脫細(xì)胞組：新鮮牛心包酶-去污劑聯(lián)合脫細(xì)胞處理。對(duì)三組牛心包進(jìn)行體外力學(xué)性能和熱皺縮溫度測(cè)試，植入雄性昆明

3、小鼠皮下三周觀察生物相容性和鈣化情況。采用vonKossa鈣染色檢查進(jìn)行定性分析；原子吸收光譜檢查進(jìn)行鈣含量定量分析。 取羊頸外靜脈5cm，膠原酶消化法獲取原代內(nèi)皮細(xì)胞，組織塊貼壁法獲取原代肌成纖維細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞采用Ⅷ因子免疫組化染色鑒定。將培養(yǎng)擴(kuò)增好的血管肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞靜態(tài)分層種植到脫細(xì)胞牛心包構(gòu)建組織工程血管補(bǔ)片，體外培養(yǎng)7天后，自體細(xì)胞/脫細(xì)胞牛心包補(bǔ)片作為實(shí)驗(yàn)組(n=5)植入羊肺動(dòng)脈，分別于4周，6周，8周，12

4、周，24周取材，單純脫細(xì)胞牛心包補(bǔ)片作為對(duì)照組(n=3)于4周，12周，24周取材，進(jìn)行大體評(píng)價(jià)和組織學(xué)檢查；測(cè)定鈣、膠原及彈性蛋白的含量。 結(jié)果：新鮮牛心包脫細(xì)胞處理后去除了細(xì)胞成分，戊二醛組的力學(xué)性能與優(yōu)于新鮮組和脫細(xì)胞組，熱皺縮溫度高于新鮮組和脫細(xì)胞組。新鮮牛心包脫細(xì)胞處理前后機(jī)械性能無(wú)明顯差異。鈣定性與定量分析結(jié)果顯示脫細(xì)胞組明顯低于戊二醛組和新鮮組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脫細(xì)胞組小鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)低，生物相容性好。

5、 羊頸靜脈分離培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和種植在脫細(xì)胞牛心包的內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子染色陽(yáng)性。 脫細(xì)胞牛心包羊肺動(dòng)脈補(bǔ)片實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物均存活，補(bǔ)片內(nèi)未見(jiàn)血栓，無(wú)明顯動(dòng)脈瘤樣擴(kuò)張，兩組(實(shí)驗(yàn)組n=5，對(duì)照組n=3)補(bǔ)片鈣含量與正常肺動(dòng)脈(n=8)比較無(wú)顯著差異。補(bǔ)片內(nèi)皮化，隨補(bǔ)片植入時(shí)間的遷移，彈性蛋白含量百分比增加，與正常肺動(dòng)脈彈性蛋白含量相似，顯示進(jìn)行性的組織重塑。 結(jié)論：牛心包脫細(xì)胞效果滿意，新鮮牛心包脫細(xì)胞處理前后機(jī)械性能無(wú)顯著差

6、異，牛心包脫細(xì)胞后小鼠皮下鈣化顯著降低，免疫源性降低，生物相容性好。無(wú)論種植細(xì)胞與否，脫細(xì)胞牛心包羊肺動(dòng)脈補(bǔ)片在體內(nèi)通過(guò)組織重塑在一定程度上可形成有活性的血管壁組織。 二、人腹主動(dòng)脈預(yù)處理為組織工程血管研究 目的:發(fā)展一種組織學(xué)加工方法處理人腹主動(dòng)脈，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)以便為組織工程血管應(yīng)用。 材料與方法:冷凍保存的人腹主動(dòng)脈按照處理方法不同分為三組。解凍組：冷凍保存的人腹主動(dòng)脈37℃生理鹽水浴處理；脫細(xì)胞組：采用酶

7、/去污劑進(jìn)行脫細(xì)胞處理；脫細(xì)胞+光氧化組：脫細(xì)胞基礎(chǔ)上繼續(xù)光氧化處理。通過(guò)組織學(xué)、透射電鏡檢查和組織成分定量分析比較解凍組和脫細(xì)胞組之間的差異。上述三組體外進(jìn)行力學(xué)性能比較，從Wistar大鼠分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到脫細(xì)胞+光氧化處理的人腹主動(dòng)脈觀察細(xì)胞黏附情況。上述三組通過(guò)大鼠皮下模型鈣原子吸收光譜儀定量分析體內(nèi)3周、9周時(shí)鈣化情況。 結(jié)果:組織學(xué)與透射電鏡檢查及組織成分分析顯示人腹主動(dòng)脈脫細(xì)胞處理后未見(jiàn)到完整的細(xì)胞和核形