熱療聯(lián)合阿霉素治療惡性血液病的實驗研究.pdf

1、背景：
　　 熱療作為一種新的腫瘤治療方法引起了廣泛的關(guān)注,但理論研究的滯后嚴重影響了腫瘤熱療的臨床實踐的深入。隨著對高溫生物學(xué)作用的深入研究以及熱療技術(shù)的提高,熱療作為放療、化療的輔助治療方法,已在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮了重要作用,被稱為第五種治療腫瘤的新方法。
　　 不同類型的腫瘤細胞對加熱的敏感性及其可能的分子生物學(xué)機制是值得研究和探討的問題之一。鹽酸阿霉素(Adriamycin,ADM)作為一種臨床廣泛應(yīng)用的化療藥

2、物,其抗腫瘤的效果顯著,為細胞周期非特異性藥物,主要用于多種實體瘤、白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤的全身治療,均有較好的療效。
　　 目前阿霉素的臨床應(yīng)用主要是與其他治療方式或藥物聯(lián)合治療實體腫瘤,而其與熱療聯(lián)合治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤,目前為止報道較少,為此,本研究以人慢性髓系白血病敏感細胞株K562、耐藥細胞株K562/ADM、人B細胞淋巴瘤細胞株Raji及多發(fā)性骨髓瘤細胞株ARH-77為研究對象,用細胞增殖實驗及流式細胞儀等多種

3、實驗方法研究熱-藥聯(lián)合在體內(nèi)外的抗瘤活性和誘導(dǎo)細胞凋亡的能力,并初步探討其作用機制,對加熱與阿霉素的聯(lián)合作用效果進行初步評價,并對全身熱療治療惡性血液病的安全性進行了評價等,為造血系統(tǒng)惡性腫瘤熱療的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論及實驗依據(jù)。
　　 第一章熱療聯(lián)合阿霉素對惡性血液病細胞株體外抑制作用的實驗研究目的觀察熱療聯(lián)合阿霉素對人慢性髓系白血病敏感細胞株K562、耐藥細胞株K562/ADM、人B細胞淋巴瘤細胞株Raji及人多發(fā)性骨髓瘤

4、細胞株ARH-77的體外增殖抑制作用及對腫瘤細胞凋亡的影響。
　　 方法
　　 1.選用K562、K562/ADM、Raji及ARH-77為研究對象,用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。
　　 2.采用MTT法確定阿霉素的工作濃度,并以該濃度進行化療或與熱療的聯(lián)合。
　　 3.選用不同溫度(40℃、41℃和42℃)和阿霉素為處理因素,采用組內(nèi)分組設(shè)計,共分為8個組,并設(shè)37℃為對照組。<

5、br>　　 4.對K562、K562/ADM、Raji及ARH-77細胞株分組處理后,臺盼藍拒染法檢測細胞的存活率,MTT比色法檢測細胞生長抑制率,并計算細胞數(shù)、克隆數(shù)及克隆形成抑制率,以及繪制細胞生長曲線等。
　　 5.流式細胞儀(FCM)檢測各細胞株不同處理組細胞凋亡率的變化。
　　 6.應(yīng)用Veleriote公式判斷藥物聯(lián)合熱療的相互作用類型。
　　 7.實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件處理,結(jié)果采用均數(shù)±

6、標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示及單向方差分析(One-wayANOVA),組間比較采用LSD法和Tamhane'sT2法。
　　 第二章熱療體外增敏作用的實驗研究目的觀察熱療聯(lián)合阿霉素對人慢性髓系白血病敏感細胞株K562、耐藥細胞株K562/ADM、人B細胞淋巴瘤細胞株Raji及人多發(fā)性骨髓瘤細胞株ARH-77細胞內(nèi)的藥物濃度變化以及對抗凋亡蛋白Bcl-2、耐藥蛋白P-gp表達的影響。
　　 方法
　　 1.選用K56

7、2、K562/ADM、Raji及ARH-77為研究對象,用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。
　　 2.采用MTT法確定阿霉素的工作濃度,并以該濃度進行化療或與熱療的聯(lián)合。
　　 3.流式細胞儀(FCM)檢測不同處理組細胞抗凋亡蛋白Bcl-2、耐藥蛋白P-gp和細胞內(nèi)藥物濃度的變化。
　　 4.實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件處理,結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示及單向方差分析(One-wa

8、yANOVA),組間比較采用LSD法和Tamhane'sT2法。
　　 第三章熱療與阿霉素聯(lián)合作用動物實驗的初步研究目的研究阿霉素與熱療聯(lián)合作用對人B細胞淋巴瘤細胞株Raji裸鼠成瘤及腫瘤生長的影響。
　　 方法
　　 將24只BALB/C裸鼠分為4組:對照組(37℃)、化療組(37℃+ADM)、熱療組(42℃)、熱化療組(42℃+ADM),每組6只。將對數(shù)生長期的Raji細胞,配制成每0.2ml含5×106個R

9、aji細胞的懸液,每只裸鼠皮下接種5×106的Raji細胞,觀察各組裸鼠成瘤時間、成瘤率、腫瘤體積變化,并繪制腫瘤生長曲線。成瘤后3周,處死老鼠,取腫塊稱重,計算抑瘤率,腫瘤組織行常規(guī)病理檢查。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件處理,結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示及單向方差分析(One-wayANOVA),組間比較采用LSD。
　　 第四章全身熱療系統(tǒng)治療惡性血液病15例:加溫、測溫和控溫技術(shù)的安全、順應(yīng)及有效性觀察目的探

10、討惡性血液病患者對全身加溫治療的耐受性,驗證全身加溫治療的順應(yīng)性、安全性及有效性。
　　 方法
　　 實驗于2005-04～2005-07在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液科完成。選擇惡性血液病患者15例,均自愿參加觀察。應(yīng)用廣東威爾醫(yī)學(xué)科技股份有限公司開發(fā)研制的WELLRAY光子熱療智能系統(tǒng),對患者進行全身加溫治療。治療前保留導(dǎo)尿,外周靜脈插管,聯(lián)接心電監(jiān)護,固定體表等溫度感受器,關(guān)艙加溫至直腸內(nèi)溫度為40～41℃,保持恒溫2

11、h,同時監(jiān)測多部位體表、空氣、治療床的溫度變化,同時行心電監(jiān)護,加溫治療前及治療后24h行血液常規(guī)和生化等各項指標(biāo)檢查。于全身熱療前及治療后24h分別應(yīng)用Karnofsky(KPS)評分評價患者的生活質(zhì)量,評分范圍0～100分,100分正常,無癥狀及體征；10分病危,臨近死亡；0分死亡。
　　 結(jié)果：
　　 第一章熱療聯(lián)合阿霉素對惡性血液病細胞株體外抑制作用的實驗研究1.阿霉素工作濃度的確定:MTT法測定阿霉素的工作濃度

12、。阿霉素對K562、K562/ADM、Raji及ARH-77的IC50分別為1.19μg/ml、53.42μg/ml、6.06μg/ml及8.16μg/ml,并以此濃度進行各項試驗。
　　 2.對細胞增殖和凋亡率的影響:各細胞株分組處理后48h,與對照組及熱療組、化療組相比,熱化療組的細胞增殖抑制率及凋亡率均明顯增加(P<0.05)。
　　 3.與對照組及熱療組、化療組相比,各細胞株的熱化療組的克隆形成數(shù)和克隆形成抑制率

13、等指標(biāo)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 第二章熱療體外增敏作用的實驗研究1.阿霉素工作濃度的確定:MTT法測定阿霉素的工作濃度。阿霉素對K562、K562/ADM、Raji及ARH-77的IC50分別為1.19μg/ml、53.42μg/ml、6.06μg/ml及8.16μg/ml,并以此濃度進行各項試驗。
　　 2.熱化療組耐藥蛋白P-gp和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達均有下調(diào),與對照組及熱療組、化療組相比,差異有

14、統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.熱化療組能明顯增加細胞內(nèi)阿霉素的藥物濃度(P<0.01)。
　　 第三章熱療與阿霉素聯(lián)合作用動物實驗的初步研究1.成瘤時間:對照組(37℃)、化療組(37℃+ADM)、熱療組(42℃)、熱化療組(42℃+ADM)的腫瘤出現(xiàn)時間分別為(11.2±1.7)、(20.2±2.3)、(15.3±1.6)及(23.8±1.7)天,熱化療組成瘤時間明顯延長(P<0.01)。
　　 2.

15、生長曲線顯示:熱化療能明顯減緩Raji細胞BALB/C裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長速度。治療結(jié)束,熱化療組的腫塊較對照組腫塊明顯縮小。腫塊稱重結(jié)果顯示:對照組(37℃)、化療組(37℃+ADM)、熱療組(42℃)、熱化療組(42℃+ADM)裸鼠的腫瘤重量分別為(3.33±0.57)g、(2.26±0.28)g、(2.76±0.26)g及(1.73±0.33)g,熱化療組的抑瘤率為48.0％。
　　 3.腫瘤組織病理學(xué)改變:成瘤組織經(jīng)HE病

16、理切片及免疫組化鑒定為人B細胞淋巴瘤,細胞呈卵圓形,細胞核呈卵圓形或不規(guī)則形,核仁較明顯,核分離相多見。
　　 第四章全身熱療系統(tǒng)治療惡性血液病15例:加溫、測溫和控溫技術(shù)的安全、順應(yīng)及有效性觀察納入患者15例,全部進入結(jié)果分析,無脫落。
　　 1.15例惡性血液病患者均能耐受40℃、120min的加熱過程,具有良好的順應(yīng)性。
　　 2.全身加溫治療后24h,患者的臨床癥狀、體征明顯好轉(zhuǎn),KPS評分平均提高10分

17、。
　　 3.全身加溫治療前及治療后24h,患者的血常規(guī)和生化等檢查指標(biāo)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.對細胞增殖和抑制率的影響:通過觀察腫瘤細胞的生長曲線、克隆形成、存活率及抑制率等指標(biāo),熱療聯(lián)合化療對耐藥及敏感細胞株均有體外抑制作用,對敏感細胞的抑制作用較強。
　　 2.對細胞凋亡率的影響:熱療與化療聯(lián)合后,細胞的凋亡率較對照組、熱療組及化療組明顯增強,并且隨著加熱溫度的增

18、加,細胞凋亡率也有增加趨勢。
　　 3.根據(jù)Veleriote法判定熱療聯(lián)合化療的相互作用類型:在本實驗條件下,熱化療對細胞的作用是協(xié)同作用和次加作用,可見熱療與化療聯(lián)合可以降低化療藥物的使用劑量。
　　 4.加熱可提高敏感細胞和耐藥細胞內(nèi)的阿霉素藥物濃度,下調(diào)耐藥蛋白P-gp及抗調(diào)亡蛋白Bcl-2的表達。
　　 5.本研究動物實驗表明:熱化療組裸鼠成瘤時間較各組明顯延長,腫瘤體積較對照組明顯減小,抑瘤率較其他各