醋柳黃酮對(duì)高血壓大鼠心血管重塑及血管舒縮功能的影響.pdf

1、目的:觀察腹主動(dòng)脈縮窄高血壓大鼠服用醋柳黃酮(TFH)治療后對(duì)血管舒縮功能的影響；探討TFH對(duì)高血壓及其所致的心血管重塑的影響及機(jī)制。方法:(1)采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備高血壓大鼠模型,隨機(jī)分為4組(n=15):對(duì)照組(Control組飲用水10 ml·kg-1)；醋柳黃酮組(TFH組30 mg·kg-1)；卡托普利組(CP組100 mg·kg-1)；TFH+CP組(Com組TFH20 mg·kg-1和CP60 mg·kg-1),連續(xù)灌胃

2、給藥,每日1次,共6周；15只作為假手術(shù)組(Sham組)。(2)采用頸動(dòng)脈插管術(shù),利用Powerlab測(cè)量術(shù)前、術(shù)后1周,用藥6周后頸動(dòng)脈血壓。(3)測(cè)量左心室重量、左室重量／體重(g／100g)比值:大鼠稱重、麻醉后,立即摘取大鼠心臟,剪斷肺靜脈,從肺動(dòng)脈瓣之上2mm處將肺動(dòng)脈剪斷,在心包的臟層轉(zhuǎn)折處剪斷主動(dòng)脈和上、下腔靜脈。取出心臟后用0.1mol.L-1、PH7.4 PBS洗滌,濾紙吸干,稱重；沿二尖瓣平面分離心房與心室,去右心室

3、,稱重。計(jì)算大鼠左室重量／體重(g／100g)比值。(4)大鼠心臟和胸主動(dòng)脈病理觀察,及胸主動(dòng)脈中膜厚度測(cè)定:取大鼠左心室、胸主動(dòng)脈,置4％甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色,鏡下觀察。應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析測(cè)量圖像軟件IPP6.0統(tǒng)計(jì),隨機(jī)取每只大鼠5個(gè)血管斷面,以血管壁中膜3、6、9、12點(diǎn)厚度平均值作為血管壁增厚的指標(biāo)。(5)血清一氧化氮(NO)活性檢測(cè):右心室采靜脈血6ml,高速離心后分離出血清,-20℃保存待用。待測(cè)血清用NO檢測(cè)

4、試劑盒,應(yīng)用硝酸還原酶法檢測(cè)血清NO活性。(6)對(duì)血管舒縮功能的影響:1)血管環(huán)制備及灌流:采血完畢,迅速剪下右腎動(dòng)脈以上的胸主動(dòng)脈,置于通以95％O2+5％CO2混合氣體的Krebs溶液中,小心去除周圍結(jié)締組織后將血管剪成約4～5 mm寬的血管環(huán)。血管環(huán)插入兩根直徑200μm銀絲做成的等腰三角形支架,其底邊與血管環(huán)等長(zhǎng),其項(xiàng)角穿入絲線結(jié)扎,移入10ml盛有Krebs液的37℃恒溫浴槽,浴槽中持續(xù)充入含95％O2+5％CO2的混合氣體。

5、絲線一端固定于浴槽底部,一端連于張力傳感器,傳感器與放大裝置相連,然后將信息輸入電腦。操作過(guò)程中避免過(guò)度牽拉,以保護(hù)內(nèi)皮的完整。用重酒石酸去甲腎上腺素(NE)10-6mol·L-1。檢測(cè)離體胸主動(dòng)脈環(huán)的活性,選擇經(jīng)NE10-6mol·L-1處理后收縮的離體胸主動(dòng)脈環(huán),靜息負(fù)荷為2g,平衡90 min,平衡期間每30 min更換Krebs液一次。2)實(shí)驗(yàn)方法:每次實(shí)驗(yàn)前,均預(yù)先用40 mmol·L-1KCl孵育最大收縮達(dá)平臺(tái)后,用Kreb

6、s液進(jìn)行洗脫六次。觀察各組血管環(huán):在亞最大收縮劑量(10-5mol·L-1)的NE預(yù)收縮最大張力達(dá)平臺(tái)后,檢測(cè)對(duì)乙酰膽堿(Ach)(3×10-7～10-4 mol·L-1)累積濃度的內(nèi)皮依賴性舒張作用,以NE預(yù)收縮最大收縮幅度為100％,加入不同濃度Ach后的血管張力幅度與NE誘發(fā)最大收縮幅度之間的百分比反映內(nèi)皮依賴性舒張的變化；左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(10-4 mol·L-1)孵育30分鐘后,再用NE10-5～mol·L-

7、1預(yù)收縮血管達(dá)穩(wěn)態(tài)后,檢測(cè)對(duì)Ach(3×10-7～10-4 mol·L-1)累積濃度的內(nèi)皮依賴性舒張作用的影響；分別測(cè)定不同濃度NE(10-7～10-4 mol·L-1)時(shí)血管的收縮改變,誘導(dǎo)動(dòng)脈環(huán)收縮反應(yīng)的程度表示為40mmol·L-1KCl最大收縮反應(yīng)的百分比。(7)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、核因子-κB(NF-κB)及左室心肌NF-κB免疫組化檢測(cè):胸主動(dòng)脈及左室心肌經(jīng)4％甲醛固定,石

8、蠟包埋后切片(4μm),常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后PBS沖洗,3％過(guò)氧化氫室溫下孵育后,高壓修復(fù),在標(biāo)本上滴加一抗,4℃濕盒中過(guò)夜,二抗孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水、二甲苯透明后,中性樹(shù)膠封片,置鏡下觀察和拍攝。另以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。采用IPP6.0分析測(cè)量圖像軟件測(cè)定陽(yáng)性物質(zhì)累積光密度(IOD)／測(cè)量組織面積所得的平均光密度值表示組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。(8)胸主動(dòng)脈

9、及心肌血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)測(cè)定:開(kāi)胸腹取出心臟、胸主動(dòng)脈于4℃生理鹽水中沖洗兩次,去除殘血及結(jié)締組織,-20℃保存待用。組織稱重并剪碎分別加4-8倍的緩沖液(成份:0.05mol／L Tris,pH7.4,0.2％牛血清白蛋白,75mmoI／L NaCl,50μmol／L ZaSO4),勻漿30秒×3,勻漿液在3900r／min(1800xg)離心15分鐘×2,均棄上清,沉淀加緩沖液再懸浮,紗布過(guò)濾,濾液用來(lái)測(cè)定ACE的活性。實(shí)驗(yàn)

10、步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值,計(jì)算樣本中ACE含量。結(jié)果:(1)TFH、CP能顯著降低高血壓大鼠收縮壓、左室重量,左室重／體重比、主動(dòng)脈中膜厚度、組織ACE活性(均P<0.05),升高血NO水平(P<0.05),且TFH和CP有協(xié)同作用。(2)免疫組化結(jié)果示:TFH、CP能顯著升高高血壓大鼠主動(dòng)脈eNOS、iNOS表達(dá)(P<0.01),降低組織NF-κB表達(dá)(P<0.01),且T

11、FH和CP有協(xié)同作用。(3)用藥組大鼠內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)較Control組顯著增加(均P<0.05),用藥組之間無(wú)差異。NO合酶抑制劑L-NAME預(yù)處理后,對(duì)Ach誘發(fā)的舒張反應(yīng),Com組明顯高于Control組(P<0.05)。對(duì)NE誘發(fā)的收縮反應(yīng),Com組顯著低于Control組(P<0.05)。TFH組和CP組在NE濃度較低時(shí)收縮反應(yīng)低于Control組(P<0.05)。結(jié)論:(1)醋柳黃酮有確切的降壓效果。(2)長(zhǎng)期服用醋柳黃酮