L-Dopa對大鼠腦5-HT能神經(jīng)元影響的實(shí)驗研究.pdf

1、目的： 帕金森病(Parkinson disease，PD)即震顫麻痹(paralvsis agitans)，是中、老年人常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病率位居老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病第2位。左旋多巴(L-Dopa)是治療PD有效的藥物，是多巴胺(DA)的合成前體。L-Dopa進(jìn)入腦后轉(zhuǎn)化為DA，可以改善帕金森病的運(yùn)動障礙。近年發(fā)現(xiàn)帕金森病患者常伴有明顯的抑郁癥狀。引起PD病人產(chǎn)生抑郁癥狀的原因很多，其中L-Dopa的毒副作用有可

2、能是造成或加重抑郁癥狀的原因之一。L-Dopa處理可誘發(fā)實(shí)驗動物的氧化應(yīng)激狀態(tài)，使黑質(zhì)致密部羥自由基形成增加、紋狀體脂質(zhì)過氧化水平增高以及DA氧化代謝產(chǎn)物形成增多，這些在損害黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的同時，也可能損害5-HT神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致或加重帕金森病患者的抑郁。已有研究表明抑郁與5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)元的功能障礙密切相關(guān)。本實(shí)驗在以往的L-Dopa神經(jīng)毒性研究的基礎(chǔ)上，選用正常大鼠，給予L-Dopa，探討其對5-HT能神經(jīng)元的毒性作用。

3、 方法： 選用健康雄性wistar大鼠24只，體重250g～280g，隨機(jī)分為實(shí)驗組和對照組，每組12只。實(shí)驗組用純度99％的L-Dopa溶于1 ml生理鹽水，100mg/kg灌胃45天，2次/日；對照組用1 ml生理鹽水灌胃45天，2次/日。免疫組織化學(xué)染色：取實(shí)驗組和對照組wistar大鼠各6只，多聚甲醛灌注30分鐘固定，取腦干下丘部位切片，分別用于5-HT和TPH免疫組織化學(xué)染色，部分用于陰性對照，切片經(jīng)0.01

4、mol/LPBS液(PH7.4)漂洗3次，5％山羊血清室溫封閉，加一抗5-HT(1：8000)，TPH(1:1000)，4℃孵育48 h，加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育2 h，加辣根過氧化物酶溶液，室溫孵育1h，每步間均以0.01mol/L TBS液(PH7.4)漂洗3次，入DAB顯色液呈色5分鐘后中止反應(yīng)，貼片、封片。流式細(xì)胞學(xué)檢測：取實(shí)驗組和對照組wistar大鼠各6只，直接斷頭取腦，取腦干下丘部位腦組織，將組織塊放入銅網(wǎng)上。先加

5、少量生理鹽水沖洗，然后用眼科剪刀將組織塊剪碎并研磨，邊研磨邊加生理鹽水，制得組織勻漿，過濾后離心．500-800轉(zhuǎn)×3分鐘。去上清，取細(xì)胞懸液加抗體，上流式細(xì)胞儀檢測5-HT和TPH表達(dá)量的高低。 結(jié)果： 1、免疫組織化學(xué)染色顯示：(1) 正常大鼠腦干5-HT能神經(jīng)元主要集中在中腦下丘階段。低倍鏡下觀察中縫背核整體形態(tài)呈噴泉狀。高倍鏡下觀察5-HT免疫組化染色觀察細(xì)胞呈棕褐色，胞體大小均一，多呈橢圓形，胞漿內(nèi)染色顆粒均一

6、，胞核可見。TPH免疫組化染色觀察與5-HT顯示結(jié)果相一致。(2)L-Dopa對大鼠腦干5-HT能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目的影響：計數(shù)結(jié)果顯示，對照組中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目為43.79±5.35；實(shí)驗組5-HT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目為38.40±3.16，P>0.05。(3)實(shí)驗組與對照組5-HT能神經(jīng)細(xì)胞灰度值比較：5-HT灰度值測定對照組為107.84±9.25，實(shí)驗組為116.16±11.8，P<0.05；TPH灰度值測定對

7、照組為87.16±6.85，實(shí)驗組為101.6±13.23，P<0.01。(4)實(shí)驗組與對照組5一HT能神經(jīng)元直徑變化的比較：中縫背核背側(cè)部和中縫背核腹側(cè)部對照組陽性細(xì)胞直徑為15.26±2.57μm，實(shí)驗組陽性細(xì)胞直徑為13.98±2.72μm，P<0.05，兩組間細(xì)胞直徑減小了8.38％；中縫背核腹外側(cè)部對照組陽性細(xì)胞直徑均數(shù)為15.39±2.62μm，實(shí)驗組陽性細(xì)胞直徑均數(shù)為13.26±2.60μm，P<0.01，兩組間細(xì)胞直徑減

8、小13.84％。 2、流式細(xì)胞結(jié)果：對照組中腦下丘節(jié)段5-HT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元5-HT的表達(dá)量為545.02±56.86，實(shí)驗組為444.48±35.35，比對照組減少了18.45％，P<0.05；對照組TPH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的TPH表達(dá)量為690.80±56.63，實(shí)驗組為553.37±27.98，比對照組減少了19.90％，P<0.05。 結(jié)論： 本實(shí)驗研究結(jié)果表明L-Dopa未能引起大鼠腦內(nèi)5-HT能神