乙醇對腦內(nèi)5-HT能體系和DA能體系影響的實驗研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們交往的增多，酒的消費也顯著增加。酒促進(jìn)交往的同時，經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道吸收，引起機(jī)體心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)，特別是神經(jīng)系統(tǒng)的損害，后者常常表現(xiàn)為抑郁、記憶力減退以及運動功能障礙等癥狀。 流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥近年呈明顯的上升趨勢，這除了與生活壓力增加、工作緊張等原因有關(guān)外，飲酒也很可能是部分人群產(chǎn)生抑郁的原因之一。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者出現(xiàn)5-羥色胺(serototlin，5-HT)體系的功能障礙，表現(xiàn)為5

2、-羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，SERT)的明顯減少。SERT是位于5-HT能神經(jīng)末梢的一種膜蛋白，通過再攝取突觸間隙的5-HT而終止5-HT的作用；它的降低除反映5-HT能神經(jīng)元的功能障礙外，還提示5-HT神經(jīng)元所支配腦區(qū)內(nèi)5-HT能神經(jīng)纖維數(shù)目的減少。因此SERT是研究5-HT能神經(jīng)元功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。 中腦邊緣多巴胺能體系(mesolimbic dopaminergic system)在藥物成

3、癮過程中起著十分重要的作用。腦內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的功能活動有賴于多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine tralasporter，DAT)的正常表達(dá)。DAT是位于DA能神經(jīng)末梢突觸前膜上的膜蛋白，能夠特異性的識別DA，將釋放到突出間隙的神經(jīng)遞質(zhì)-DA快速的再攝取到突觸前神經(jīng)末梢內(nèi)，從而終止神經(jīng)信息的傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)DAT是可卡因等一些精神興奮藥物的作用靶點。有學(xué)者通過對可卡因成癮者的尸檢材料研究發(fā)現(xiàn)，可卡因成癮者腦內(nèi)紋狀體

4、DAT結(jié)合位點明顯增加；動物實驗進(jìn)一步證實了DAT結(jié)合點增加的結(jié)果。這些研究均提示DAT是可卡因成癮的一種狀態(tài)指標(biāo)。酗酒成癮是否也如可卡因等精神興奮藥物一樣提高DAT的表達(dá)，目前尚無研究。 本研究利用免疫放射自顯影法、免疫細(xì)胞化學(xué)、形態(tài)測量學(xué)、免疫印跡、流式細(xì)胞技術(shù)及透射電鏡等方法，通過對酗酒人腦標(biāo)本及乙醇處理大鼠5一HT能和DA能體系不同腦區(qū)的研究，分析酗酒和乙醇對SERT和DAT表達(dá)的影響，期望為酗酒者癥狀的解釋及酒精成癮提

5、供實驗形態(tài)學(xué)依據(jù)。 第一部分：SERT在人腦不同區(qū)域分布的免疫放射自顯影研究 目的：定量分析人腦標(biāo)本不同區(qū)域內(nèi)SERT的免疫反應(yīng)強度，1.為研究酗酒人腦標(biāo)本SERT蛋白的改變提供適宜的觀察部位和實驗數(shù)據(jù);2.為臨屎應(yīng)用SERT配基檢測抑郁等疾病選擇參照區(qū)提供神經(jīng)解剖學(xué)依據(jù)。 方法：收集5例男性人腦標(biāo)本，依據(jù)人腦圖譜定位、取腦，爾后切成3～5mm厚的腦片，經(jīng)甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，開始切片進(jìn)行免疫放射自

6、顯影研究，顯影、定影，以Luxol Fast Blue復(fù)染切片，掃描儀掃描膠片(300dpi)，以TIFF格式儲存，用AIS軟件測量感興區(qū)密度即SERT免疫反應(yīng)強度(顯微鏡下觀察復(fù)染切片，用鼠標(biāo)勾畫圖像相應(yīng)核團(tuán)邊界，以<'125>I-standards校正的<'14>C-starIdards曲線，測量邊界內(nèi)圖像密度，計算膠片圖像與切片對應(yīng)核團(tuán)的<'125>I強度。所得值減去對照組相同核團(tuán)背景標(biāo)記值為特異性標(biāo)記結(jié)果(nCi/mg)。

7、 結(jié)論：1.SERT蛋白在5-HT能神經(jīng)元投射源區(qū)中以中腦中縫背核表達(dá)最高。在5-HT能神經(jīng)元投射靶區(qū)中以中腦黑質(zhì)、腹側(cè)被蓋區(qū)表達(dá)最明顯；扣帶回前部膝周皮質(zhì)次之；小腦皮質(zhì)和胼胝體表達(dá)最低。2.小腦皮質(zhì)含有極少量SERT蛋白，如果放射性配基選擇適當(dāng)，應(yīng)是臨床配基顯像技術(shù)檢測SERT變化診斷相關(guān)疾病的理想?yún)⒄諈^(qū)。 第二部分：SERT在酗酒人腦標(biāo)本的表達(dá)改變 目的：觀察酗酒人腦標(biāo)本不同區(qū)域內(nèi)SERT免疫反應(yīng)強度，判定SERT

8、蛋白含量的改變。 方法：收集10例男性腦標(biāo)本，對照組和酗酒組各5例，其余同上。 結(jié)論：酗酒人腦標(biāo)本中縫背核、黑質(zhì)以及扣帶回前部膝周皮質(zhì)SERT蛋白表達(dá)減少，提示酗酒者腦內(nèi)存在5-HT能神經(jīng)活動的障礙。 第三部分：乙醇處理對大鼠腦內(nèi)5.HT能體系的影響 目的：觀察乙醇處理對大鼠腦內(nèi)不同區(qū)域SERT、5-HT和TPH表達(dá)的影響，判斷乙醇對腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)體系的損害。 方法：選取3月齡體重為250-3

9、00 g Wistar大鼠120只，雄性(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，隨機(jī)分為對照組和乙醇處理組，對照組給予正常飲食飲水，乙醇處理組給予正常飼料，以20％酒精代替飲水。各組實驗動物分別飼養(yǎng)6個月。 1.免疫組織化學(xué)研究：深麻醉下，經(jīng)左心室-升主動脈灌注生理鹽水100 ml，4℃ 4％多聚甲醛400 ml 1 h，開顱取腦，后固定4 h，蔗糖溶液4℃過夜。按需要把腦塊行冠狀位切片，免疫組織化學(xué)染色。 2.流式細(xì)胞學(xué)檢測

10、：將所需大鼠直接斷頭取腦，于冰板上取所需腦組織，放在120目不銹鋼網(wǎng)上，邊搓邊用生理鹽水沖洗，過濾、收集細(xì)胞懸液，500-800轉(zhuǎn)離心制備單細(xì)胞懸液。取單細(xì)胞懸液1×10<'6>/ml，分別加入1：100鼠抗TPH單克隆抗體、兔抗SERT的多克隆抗體及兔抗5-HT的多克隆抗體各0.1 ml，室溫孵育，PBS洗滌，棄上清，分別加入羊抗鼠異硫氫熒光素(FITC-IgG)及羊抗兔藻紅素蛋白(PE-IgG)二抗工作液各0.1 ml，避光室溫孵育

11、，加人PBS 10 ml離心同上，棄上清，加入PBS 0.1 ml經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測，電腦記錄，計數(shù)SERT、TPH和5-HT的表達(dá)量X-mode值。 3.Western-Blot檢測：所需大鼠斷頭取腦，冰板上用刀片取所需腦組織，加入蛋白裂解緩沖液，放入O℃水浴研磨，靜置1 h，4℃、1 5000 r/min離心25 min，取上清液。以考馬斯亮藍(lán)液在紫外一可見分光光度計上進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=樣品

12、光密度值/標(biāo)準(zhǔn)管光密度值×2.5，蛋白樣品分裝，-80℃保存。 結(jié)論：1.乙醇處理引起大鼠腦內(nèi)中縫背核5-HT能免疫反應(yīng)神經(jīng)元數(shù)目減少、直徑變小。2.乙醇處理導(dǎo)致5-HT能體系SERT、5-HT和TPH表達(dá)降低。3.乙醇處理引起中縫背核神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變。 第四部分：乙醇處理對大鼠腦內(nèi)DA能體系的影響 目的：觀察乙醇處理組大鼠腦內(nèi)不同區(qū)域DAT和TH的表達(dá)變化，探討酒精成癮的可能機(jī)制，為戒斷酒精成癮提供實驗依據(jù)。

13、 方法：同第三部分。1.免疫組織化學(xué)研究：一抗為大鼠抗DAT多克隆抗體和小鼠抗TH單克隆抗體，二抗為羊抗大鼠IgG和羊抗小鼠IgG，觀察分析DA能免疫反應(yīng)神經(jīng)元或纖維TH和DAT，腦區(qū)為黑質(zhì)、紋狀體和扣帶回，其余同第三部分。2流式細(xì)胞學(xué)檢測：抗體為鼠抗TH單克隆抗體和羊抗鼠異硫氫熒光素(FITC-IgG)，其余同第三部分。3.Western-Blot檢測：所用抗體為小鼠抗TH單克隆抗體和大鼠抗DAT多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記

14、羊抗小鼠或大鼠IgG，確定雜交條帶TH和DAT的相對吸光度值。其余同第三部分。4.透射電鏡觀察：取出所要觀察的部分中腑黑質(zhì)，其余同第三部分。 結(jié)論：1.乙醇處理引起大鼠黑質(zhì)DA能免疫反應(yīng)神經(jīng)元數(shù)目減少、細(xì)胞變小。 2.乙醇處理引起大鼠腦內(nèi)DAT表達(dá)增加，可能與酒精成癮有關(guān)。 第五部分：DAT在人腦不同區(qū)域分布的免疫放射自顯影研究 目的：定量分析人腦標(biāo)本不同區(qū)域內(nèi)DAT的免疫反應(yīng)強度：1.為酗酒人腦標(biāo)本DAT蛋白的

15、研究提供適宜的觀察部位和實驗數(shù)據(jù)。2.為臨床應(yīng)用DAT配基檢測或研究相關(guān)疾病參照區(qū)的選擇提供神經(jīng)解剖學(xué)依據(jù)。 方法：同第一部分 結(jié)果：1.DAT標(biāo)記一般觀察所觀察的腦區(qū)中，DAT免疫反應(yīng)強標(biāo)記信號主要分布在中腦的黑質(zhì)、端腦的殼及尾狀核；另外端腦額葉、枕葉也可見弱的DAT標(biāo)記；而小腦皮質(zhì)標(biāo)記信號最弱；2.DAT標(biāo)記強度分析所觀察腦區(qū)測量結(jié)果顯示：DAT免疫反應(yīng)強度在黑質(zhì)為1.50±0.40，尾狀核為2.10±0.26，殼為

16、1.54±0.18，額葉皮質(zhì)為0.63±0.38，枕葉皮質(zhì)為0.23±0.02，扣帶回為0.67±0.44，小腦皮質(zhì)為0.18±0.15(Fig.2，Table 1)。可以看出小腦皮質(zhì)是各個腦區(qū)DAT免疫反應(yīng)強度標(biāo)記最低的部位，僅分別占黑質(zhì)、尾狀核、殼的1/8.33、1/11.67、1/8.56，而額葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)及扣帶回DAT的標(biāo)記強度則分別為小腦皮質(zhì)的3.50、1.28、和3.72倍：小腦皮質(zhì)DAT的標(biāo)記強度更接近白質(zhì)(胼胝體)，