加味小柴胡湯的抗急性肝細胞損傷作用及其機理研究.pdf

1、研究意義與目的: 肝細胞損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理變化，其長期存在往往是導致肝纖維化，甚至是肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動因素。因此防治肝細胞損傷是臨床肝病治療的主要環(huán)節(jié)之一。肝細胞損傷機制復雜，隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，人們對肝細胞損傷的認識已進入到細胞分子水平，對中醫(yī)防治肝細胞損傷作用機制的認識也由保護肝細胞膜、降低轉(zhuǎn)氨酶等淺層面逐漸深入。肝細胞損傷是一種由多因素介導的復雜的生物學過程，損傷的結(jié)果是肝細胞可能發(fā)生凋亡或壞死。近年

2、來的研究表明，相比其他機制來講，細胞凋亡在肝細胞損傷中發(fā)揮著更為重要的作用。Caspase(半胱天冬酶)介導的細胞凋亡是當前肝細胞損傷凋亡機理研究當中的一個重要研究內(nèi)容，而中醫(yī)藥在此方向的研究較為分散，尚未形成體系。 小柴胡湯出自《傷寒論》，在長期的醫(yī)療實踐中，廣泛用于肝膽、消化、免疫等系統(tǒng)疾病的治療。中醫(yī)學認為引起肝細胞損傷的病因多為感受時邪，或飲酒過度，或情志失調(diào)，或久病體虛等，脾虛、陰虛及瘀血是其常見的病理改變，但小柴胡湯

3、中健脾、養(yǎng)陰及活血的藥力卻顯不足。依據(jù)導師的臨床經(jīng)驗，本課題在原方基礎上加入茯苓、白術、白芍、當歸、丹參等健脾、養(yǎng)陰及活血中藥構(gòu)成加味小柴胡湯。根據(jù)中醫(yī)防治肝細胞損傷作用機制研究趨勢，通過觀察加味小柴胡湯對刀豆蛋白A、D-氨基半乳糖所致急性肝損傷模型的影響，評價與比較加味小柴胡湯的抗肝細胞損傷作用，并通過對信號通路調(diào)節(jié)相關基因及其表達的檢測，探索加味小柴胡湯對小鼠肝細胞損傷中肝細胞凋亡信號通路調(diào)節(jié)的作用機制。 方法: 1

4、.兩種小柴胡湯急性毒性實驗(改進寇氏法)：NIH小鼠隨機分為小柴胡湯80g/kg/d組、40g/kg/d組、20g/kg/d組、10g/kg/d組，加味小柴胡湯80g/kg/d組、40g/kg/d組、20g/kg/d組、10g/kg/d組，同時設正常對照組。加味小柴胡湯組及小柴胡湯組均按80、40、20、10g/kg/d的劑量配制給藥，正常對照組用等量生理鹽水灌胃。給藥后觀察5天，逐日記錄中毒癥狀、死亡情況，死亡動物及時尸解，記錄病變情

5、況，若肉眼可見病變組織時，進行該組織的病理形態(tài)學檢查。通過上述實驗的觀察，以測定不同濃度的加味小柴胡湯及小柴胡湯對小鼠的毒副作用，從而確定試驗的劑量范圍。 2.兩種小柴胡湯對刀豆蛋白A所致急性肝細胞損傷的保護作用：將NIH雄性小鼠分為加味小柴胡湯大、中、小劑量組、正常組、聯(lián)苯雙酯組、模型組及小柴胡湯組。分別于首日上、下午和次日下午按加味小柴胡湯40、20、10g/kg/d，小柴胡湯40g/kg/d，聯(lián)苯雙酯150mg/kg/d劑

6、量灌胃給藥，正常組和模型組給予生理鹽水。末次給藥后4h，除正常組，其余各組小鼠均一次性尾靜脈注射ConA 20mg/kg，禁食，不禁水，建立ConA致小鼠急性肝細胞損傷的動物模型。8h后摘小鼠眼球取血，不抗凝取血清。血清獲取后分為兩部分，分別置于-20℃和-70℃冰箱中保存。取肝左葉組織，10％甲醛溶液固定。通過對肝細胞損傷小鼠的ALT、AST、腫瘤壞死因子(TNF-α)、小鼠干擾素γ(IFN-γ)，以及對肝組織的病理學檢查，探討及比較

7、兩種小柴胡湯可能的保肝降酶、TNF-α、IFN-γ含量的改變、防止肝細胞損傷的作用和機理所在。 3.加味小柴胡湯對D-氨基半乳糖所致急性肝細胞損傷的保護作用：將NIH小鼠60只分為正常組、模型組、加味小柴胡湯大、中、小劑量組及聯(lián)苯雙酯組。分別給小鼠以加味小柴胡湯40、20、10g/kg/d，聯(lián)苯雙酯150mg/kg/d灌胃，正常組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，共7天，第6天，模型組和治療組按0.5g/kg劑量腹腔注射D-氨基半乳

8、糖，建立D-氨基半乳糖致小鼠急性肝細胞損傷的動物模型，正常組同時腹腔注射等體積生理鹽水。腹腔注射24h后，摘眼球取血，分離血清。小鼠處死后，迅速取出肝臟，10％甲醛溶液固定。通過對肝細胞損傷小鼠的ALT、AST、SOD、MDA、NO，半定量RT-PCR法檢測Fas及FasL基因mRNA表達以及肝組織病理檢查等指標的檢測，探討加味小柴胡湯的保肝降酶、抗氧化、防止肝細胞損傷及肝細胞凋亡的作用和機理所在。 結(jié)論: 1.加味小柴