骨髓間充質(zhì)干-祖細(xì)胞增殖和分化的工程化微環(huán)境研究.pdf

1、骨髓基質(zhì)含有一種非造血細(xì)胞，稱為骨髓間充質(zhì)干/祖細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal stem/progenitor cells, BMSCs)。BMSCs來源廣泛，分離培養(yǎng)容易，并具有多向分化潛能，是理想的組織工程種子細(xì)胞。體內(nèi)BMSCs存在于復(fù)雜的微環(huán)境中，包括各種生長因子和細(xì)胞因子、細(xì)胞之間以及細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、力學(xué)因素以及物化因素等都對BMSCs增殖分化產(chǎn)生影響。因此，研究上述因素對BMSCs增殖及分化的影響

2、對于體外構(gòu)建組織工程微環(huán)境及指導(dǎo)BMSCs臨床應(yīng)用具有重要的參考意義。 本研究應(yīng)用兩水平全因子實驗和響應(yīng)曲面分析方法定量考察了微環(huán)境中細(xì)胞因子表皮生長因子EGF和血小板衍生生長因子PDGF-BB和細(xì)胞外基質(zhì)纖連蛋白FN以及它們之間的相互作用對細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞周期的影響。兩水平全因子設(shè)計實驗結(jié)果表明，添加細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白后，細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生了明顯的變化；同時，細(xì)胞周期也有所改變，G0/G1期細(xì)胞減少。MTT實驗結(jié)果

3、表明，除了FN，其它因子及其相互作用均對BMSCs增殖有顯著影響。因此，在響應(yīng)曲面分析實驗中選取EGF和PDGF-BB來優(yōu)化其濃度。盡管本研究中測量的濃度并沒有出現(xiàn)在BMSCs擴增的最大值范圍內(nèi)，但我們選用的因子濃度可以擬合一個有效的二次方程，因此對于有效地預(yù)測一定因子濃度范圍內(nèi)BMSCs的擴增具有參考意義。 其次，為考察力學(xué)因素和物化因素對BMSCs生長的影響，本研究設(shè)計和構(gòu)建了一套模塊式三維灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)；該系統(tǒng)整合了細(xì)

4、胞接種和長期培養(yǎng)的功能，通過計算可獲得可控的力學(xué)微環(huán)境。針對靜止、攪動、離心、轉(zhuǎn)瓶和灌注五種接種方法對BMSCs在非紡型PET支架上的接種效率、細(xì)胞分布及接種后形成組織的能力進(jìn)行了系統(tǒng)比較。DNA含量分析、MTT染色以及組織切片結(jié)果表明，灌注培養(yǎng)產(chǎn)生最均一的細(xì)胞分布和相對高的細(xì)胞量；生長12天后，其形成組織的能力最強。此外，將細(xì)胞/支架結(jié)構(gòu)體在孔板、轉(zhuǎn)瓶和灌注三種不同系統(tǒng)培養(yǎng)8天結(jié)果同樣顯示，灌注培養(yǎng)過程中細(xì)胞在支架材料上分布更為均一。