產(chǎn)前雄激素化的SD雌鼠多囊卵巢綜合征樣特征.pdf

1、前言:
　　多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,簡(jiǎn)稱PCOS),是一種常見(jiàn)的婦科內(nèi)分泌疾病,以持續(xù)不排卵和高雄激素為主要特征,其發(fā)生率占育齡婦女的5~10％,占不排卵婦女的75~80%。PCOS的統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)始見(jiàn)于1935年,Stein和Leventhal描述為閉經(jīng)、多毛和雙側(cè)卵巢多囊性增大的無(wú)排卵相關(guān)綜合征。1990年美國(guó)國(guó)家健康委員會(huì)(National Institute of Health,

2、NIH)會(huì)議規(guī)定其診斷標(biāo)準(zhǔn)為“臨床或生化有高雄激素表現(xiàn),持續(xù)無(wú)排卵和除外其他疾病”。但經(jīng)多年臨床觀察發(fā)現(xiàn),大部分 PCOS患者超聲有卵巢多囊性改變。因此,關(guān)于這個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)一直存在爭(zhēng)議。2003年在荷蘭鹿特丹(Rotterdam)定義了PCOS新的診斷標(biāo)準(zhǔn),把卵巢的形態(tài)學(xué)改變“多囊性卵巢”作為其診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn):
　　(1)排卵少或不排卵;
　　(2)有高雄激素血癥的臨床和生化特征;
　　(3)超聲檢查有多囊

3、性卵巢。排除其它雄激素過(guò)高相關(guān)疾病。
　　2006年雄激素過(guò)高協(xié)會(huì)(Androgen Excess Society,AES)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為:
　　(1)多毛及/或高雄激素血癥;
　　(2)稀發(fā)排卵或無(wú)排卵及/或多囊卵巢;
　　(3)排除其它雄激素過(guò)高相關(guān)疾病,如先天性腎上腺增生癥(Congenital adrenal hyperplasia,CAH)、柯興氏征、高泌乳素血癥、嚴(yán)重的胰島素抵抗綜合征、分泌雄激素的腫瘤、甲

4、狀腺功能異常等。
　　此外還有與PCOS相關(guān)的體征和癥狀:
　　生殖內(nèi)分泌方面,有:
　　(1)LH分泌過(guò)高;
　　(2)腎上腺雄激素分泌過(guò)高;
　　(3)卵巢對(duì)促性腺激素刺激反應(yīng)性過(guò)高;
　　(4)高流產(chǎn)率;
　　(5)子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌;
　　(6)妊娠期糖尿病,等。
　　代謝方面,有:
　　(1)胰島素抵抗及高胰島素血癥;
　　(2)葡萄糖耐量降低;
　

5、　(3)II型糖尿病;
　　(4)肥胖;
　　(5)胰腺對(duì)葡萄糖反應(yīng)受損;
　　(6)高脂血癥,等。
　　此外心血管疾病、睡眠呼吸暫停綜合征、痤瘡、慢性炎癥的發(fā)病率增加。
　　但目前其發(fā)病原因仍不清楚,現(xiàn)多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:可能是一種遺傳因素和環(huán)境因素共同決定的多因素異質(zhì)性疾病,治療方面只能治標(biāo)不能治本,需要藥物維持才能緩解癥狀。因此,進(jìn)一步探討其病因及發(fā)病機(jī)制對(duì)PCOS的治療有極大的推動(dòng)作用。然而,對(duì)人體進(jìn)行P

6、COS研究存在局限性,尤其是在發(fā)病機(jī)制方面,因此對(duì)相應(yīng)模型動(dòng)物的研究也成為一種必需,所建立的模型如外源性雄激素所造模型、雌激素所造模型、持續(xù)光照所造模型,盡管均能夠從不同側(cè)面反映 PCOS,但是不能夠全面反映 PCOS內(nèi)分泌改變及局部性腺病理改變,也不能夠充分說(shuō)明其發(fā)病原因。
　　為了解決上述矛盾,科學(xué)家作了大量研究,研究者發(fā)現(xiàn):胎兒時(shí)期,身體各組織和器官都會(huì)經(jīng)歷發(fā)育的敏感階段,此敏感階段可能與細(xì)胞的快速分裂相關(guān)。如果在這個(gè)敏感階

7、段受到某種刺激或損傷,將會(huì)導(dǎo)致終生的影響。最近對(duì)動(dòng)物研究表明,PCOS可能與此有關(guān)?？赡苁怯捎谠谌焉锾浩?循環(huán)雄激素過(guò)高刺激下,對(duì)胎兒生殖腺等產(chǎn)生影響,導(dǎo)致成年后PCOS的發(fā)生。Abbott等對(duì)猴的研究已證實(shí),妊娠期暴露過(guò)高雄激素的雌性恒河猴,成年后的體征和癥狀與PCOS患者相似,第一次對(duì)PCOS發(fā)生起源進(jìn)行了觀察,證實(shí)了PCOS的“成人疾病胎源說(shuō)”觀點(diǎn)。
　　由于上述原因,本課題選擇 Sprague—Dawley(SD)大鼠(

8、正常妊娠周期為21~22天)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),對(duì)此大鼠于妊娠期16~19天每日皮下注射睪酮(Testosterone,T)或者雙氫睪酮(Dihydrotestostrone,DHT)4mg,注藥劑量選擇參考了以前有關(guān)研究者關(guān)于 SD大鼠下丘腦研究的相關(guān)文獻(xiàn)資料。此注射時(shí)間和劑量選擇依據(jù):在妊娠過(guò)程中給予此雄激素劑量能夠部分雄性化肛門-生殖器距離和性行為。本研究以期其癥狀與體征與PCOS患者更加相似,并在此基礎(chǔ)上,對(duì)PCOS的發(fā)病機(jī)制及原因進(jìn)行更

9、深入的分析探究。
　　目的:
　　PCOS發(fā)病原因未明,進(jìn)一步探討其病因及發(fā)病機(jī)制對(duì)PCOS的診斷治療有極大的推動(dòng)作用。然而,對(duì)人進(jìn)行發(fā)病機(jī)制方面的研究尚有局限性,如不能切除卵巢,不能獲得下丘腦等性腺軸標(biāo)本等等。而且,目前許多動(dòng)物模型也僅僅從不同側(cè)面反映PCOS的相關(guān)體征和癥狀,未進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平探討其發(fā)病原因。由于上述原因,本課題使用 SD大鼠妊娠期給予雄激素即模擬妊娠期過(guò)高雄激素狀態(tài),觀察雄激素對(duì)動(dòng)物的影響,并在此

10、基礎(chǔ)上,對(duì)PCOS的原因進(jìn)行深入的分析探究。具體為:
　　1. SD大鼠在妊娠期16~19天每日皮下注射T或者DHT4mg構(gòu)造出妊娠期雄激素過(guò)高大鼠。對(duì)妊娠期雄激素過(guò)高和對(duì)照組 SD大鼠卵巢切除后進(jìn)行苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)刺激,分析孕酮受體(Progesterone Receptor,PgR)mRNA的表達(dá)水平,從分子生物學(xué)方面了解妊娠期雄激素過(guò)高大鼠下丘腦的變化情況。
　　2.觀察各組出

11、生后雌性小鼠外生殖器的變化,了解妊娠期雄激素過(guò)高對(duì)雌鼠外生殖器的影響。
　　3.觀察妊娠期雄激素過(guò)高雌性大鼠動(dòng)情周期及激素分泌方式的改變情況,與 PCOS患者內(nèi)分泌及月經(jīng)周期變化的相似性進(jìn)行比較。
　　4.對(duì)妊娠期雄激素過(guò)高及正常雌性大鼠的代謝特征進(jìn)行研究,了解各組大鼠代謝特征的變化。
　　方法:
　　1.大鼠以4:1或3:1雌雄比例合籠,出現(xiàn)陰道栓為妊娠第1天。后在妊娠16~19天實(shí)驗(yàn)組皮下注射上述睪酮或雙氫睪

12、酮4mg+0.2ml注射用油,空白組注射0.2ml注射用油,出生后81日(SD大鼠60日后處于成年期,生理結(jié)構(gòu)發(fā)育完善)上午11:00~11:30對(duì)照組在動(dòng)情間期手術(shù)切除卵巢,實(shí)驗(yàn)組在相同時(shí)間進(jìn)行同樣處理,然后迅速注射苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)30μg,第二天中午12點(diǎn)迅速斷頭處死大鼠,取出的下丘腦視前區(qū)(Preoptic area,POA),迅速放入液氮中保存。然后進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),分析其PgR m

13、RNA表達(dá)情況,從分子生物學(xué)方面了解妊娠期雄激素對(duì)成年后下丘腦的影響。
　　2.給藥方式同上,小鼠在出生后第2日、第22日、第60日(Postnatal day2,PND2;同樣,PND22,PND60),測(cè)量肛門生殖器距離(Anogenital distance,AGD);第13日檢查乳頭情況。
　　3.給藥方式同上。(1)60~70日時(shí),上午11:00~11:30對(duì)照組仔鼠在動(dòng)情間期,實(shí)驗(yàn)組在相同日期(無(wú)陰道,不能進(jìn)行陰

14、道涂片),戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg,ip),無(wú)菌注射器下腔靜脈采血,制備的血清觀察激素(E2,P,T,LH)分泌變化。(2)對(duì)照組在動(dòng)情間期,實(shí)驗(yàn)組在同一時(shí)間手術(shù)切除卵巢,第7天12:00~15:00,每10分鐘眼眶靜脈取血一次共3小時(shí),血清進(jìn)行LH放免測(cè)定,了解LH分泌的頻率和振幅變化。
　　4.在出生后小鼠70日的晚上8時(shí)開(kāi)始禁食,次日上午8時(shí)按3g葡萄糖/kg體重的劑量灌服50%葡萄糖液,灌糖后分別在0、30、60、1

15、20min鼠尾尖取血,采用血糖儀檢測(cè)血糖,放免檢測(cè)法胰島素。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢切除后EB刺激,其PgR mRNA表達(dá)情況比較:各組老鼠卵巢切除后,EB刺激,對(duì)照組PgRmRNA(1.2112±0.2355)表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)T組(0.5017±0.3234)和DHT組(0.4123±0.2876),均P<0.05。
　　2.(1)出生后各組仔鼠AGD。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)T組、DHT組間分別比較:PND2(依次為:1.4±

16、0.1 vs1.6±0.1,1.4±0.1 vs1.7±0.1,均P<0.01);PND22(依次為10.5±0.4 vs14.2±1.1,10.5±0.4 vs14.9±0.5,均P<0.01);PND60(依次為15.1±0.5 vs19.1±0.4,15.1±0.5 vs19.0±0.3,均P<0.01)。但實(shí)驗(yàn)組間比較:PND2(依次為:1.6±0.1 vs1.7±0.1, P>0.05);PND22(依次為14.2±1.1 v

17、s14.9±0.5,P>0.05);PND60(依次為19.1±0.4 vs19.0±0.3,P>0.05)。(2)出生后各組仔鼠PND13乳暈檢查。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)T組、DHT組間比較:正常乳暈數(shù)(11.9±0.3 vs1.5±0.5,11.9±0.3 vs1.3±0.5,均P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組間(1.5±0.5 vs1.3±0.5,P>0.05)?？?cè)闀灁?shù)(12±0.0 vs2.8±0.8,12±0.0 vs2.4±0.7, P<0.

18、05);實(shí)驗(yàn)組間(2.8±0.8 vs2.4±0.7,P>0.05)。
　　3.(1)激素測(cè)定結(jié)果。對(duì)照組分別與實(shí)驗(yàn)組(T組,DHT組)比較:依次分別為E2(15.3±0.5vs23.0±1.2,15.3±0.5 vs23.0±1.2,P<0.05)(ng/ml);P(15.3±0.7 vs24.7±0.6,15.3±0.7 vs24.7±2.1, P<0.05)(ng/ml);LH(0.44±0.07 vs0.77±0.07,0

19、.44±0.07 vs0.76±0.07,P<0.05)(ng/ml),三種激素比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T(0.019±0.007 vs0.021±0.008,0.019±0.007 vs0.024±0.008,P>0.05)(ng/ml),對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組T水平比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組間各組激素對(duì)應(yīng)比較,均P>0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)各組大鼠LH分泌頻率和幅度測(cè)定。觀察發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)T組大鼠與對(duì)照組相比,頻率增加,幅度更大;但實(shí)驗(yàn)DHA

20、組由于實(shí)驗(yàn)原因沒(méi)有得出類似結(jié)果。
　　4.妊娠期雄激素過(guò)高及正常組大鼠OGTT結(jié)果比較。三組空腹血糖分別為(4.4±0.2 vs4.4±0.3,4.4±0.2 vs4.3±0.2,P>0.05)(mmol/L);1h血糖(7.43±0.21 vs7.45±0.22,7.43±0.21 vs7.31±0.34,P>0.05)(mmol/L);2h血糖(6.18±0.14 vs6.18±0.14,6.18±0.14 vs6.06±0.

21、20, P>0.05)(mmol/L)。三組空腹胰島素分別為(13.9±1.0 vs14.2±0.6,13.9±1.0 vs14.2±1.0, P>0.05)(mU/L);2h胰島素(12.0±0.7 vs11.5±0.8,12.0±0.7 vs11.9±1.0,P>0.05)(mU/L)。
　　結(jié)論:
　　1.正常雌鼠E2給予能夠誘導(dǎo)PgR mRNA的表達(dá)產(chǎn)生LH峰,妊娠期雄激素過(guò)高大鼠(T組和DHT組)E2給予誘導(dǎo)產(chǎn)生P

22、gR mRNA減少,PgR mRNA分泌的減少進(jìn)而導(dǎo)致下丘腦分泌GnRH減少,從而不產(chǎn)生LH峰。與PCOS患者LH分泌異常、稀發(fā)排卵或不排卵癥狀一致,這抑或是PCOS排卵障礙的原因之一。
　　2.妊娠期雄激素過(guò)高大鼠AGD明顯增加,乳頭數(shù)明顯減少,出現(xiàn)假兩性畸形。與人類有關(guān)疾病發(fā)生相似,如孕期使用雄激素及合成的孕激素:可致女性假兩性畸形。但PCOS患者很少出現(xiàn)有外生殖器雄性化改變。分析原因:由于晚成雛哺乳動(dòng)物,如SD大鼠,出生時(shí)外

23、生殖器和神經(jīng)系統(tǒng)處于分化發(fā)育中期,出生前后幾天時(shí)間內(nèi)生殖器對(duì)雄激素反應(yīng)敏感,因此這類哺乳動(dòng)物,在妊娠晚期暴露過(guò)多雄激素,生殖器雄性化;而人類,雄激素對(duì)生殖器的雄性化作用的敏感時(shí)間僅持續(xù)到妊娠中期。
　　3.妊娠期雄激素過(guò)高大鼠:表現(xiàn)出LH分泌量和頻率均增加,動(dòng)情周期改變(周期延長(zhǎng))。與PCOS患者月經(jīng)失調(diào)癥狀,以及LH/FSH比值高相似,推測(cè)可能與PCOS患者妊娠期雄激素過(guò)高有關(guān)。
　　4.妊娠期雄激素過(guò)高大鼠糖代謝變化無(wú)異