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1、組蛋白γH2AX是一個(gè)近期發(fā)現(xiàn)的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白,其在DNA損傷修復(fù)中的主要作用是:“錨定”于DNA雙鏈斷裂(DSBs)處,為DNA損傷修復(fù)因子的集合和修復(fù)損傷提供必需的場(chǎng)所。電離輻射或其他因素導(dǎo)致DSBs產(chǎn)生后,ATM、ATR和DNA-PKs被激活,這些磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)家族的成員可以磷酸化DSBs處的組蛋白H2AX羧基末端的<'139>ser,使組蛋白H2AX轉(zhuǎn)變?yōu)棣肏2AX。 已有研究證實(shí)γH2AX的
2、產(chǎn)生數(shù)量與DNA雙鏈斷裂(DSBs)數(shù)量之間成線性正相關(guān)的關(guān)系,分別用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡的檢測(cè)方法在體外研究了γH2AX水平與電離輻射劑量的關(guān)系,二者呈現(xiàn)良好的直線相關(guān)。此外,研究發(fā)現(xiàn)不同放射敏感性的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞被照射后,其γH2AX時(shí)間效應(yīng)參數(shù),如:半衰時(shí)間τ<,1/2>與集落形成實(shí)驗(yàn)的2Gy存活系數(shù)SF<,2>存在良好的相關(guān)性(R<'2>=0.75)。因此,γH2AX是一個(gè)新的檢測(cè)DNA雙鏈斷裂(DSBs)的靈敏方法,并有
3、希望成為一個(gè)新的代替2Gy存活系數(shù)SF<,2>的細(xì)胞放射敏感性指標(biāo)。 γH2AX與細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)性研究的基礎(chǔ)應(yīng)該至少包括:建立一個(gè)具有良好劑量反應(yīng)關(guān)系的γH2AX檢測(cè)方法以及對(duì)于照射后γH2AX時(shí)間效應(yīng)的深入了解。因此我們?cè)诒狙芯恐兄饕槍?duì)這兩個(gè)方面進(jìn)行了探討。 本研究主要分為兩大部分,第一部分我們使用不同實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞在不同劑量射線照射后γH2AX水平,比較其檢測(cè)結(jié)果,并用中性單細(xì)胞凝膠電泳驗(yàn)證,以發(fā)現(xiàn)不同
4、檢測(cè)方法γH2AX劑量反應(yīng)結(jié)果的異同和篩選出一個(gè)進(jìn)行后繼研究的適當(dāng)檢測(cè)方法。第二部分研究了不同劑量下腫瘤細(xì)胞照射后γH2AX時(shí)間效應(yīng),對(duì)其時(shí)間效應(yīng)進(jìn)行了曲線擬合分析,以發(fā)現(xiàn)照射劑量對(duì)γH2AX時(shí)間效應(yīng)各參數(shù)的影響。 通過(guò)上述研究,我們得到如下結(jié)果和結(jié)淪: 1.在使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γH2AX輻射劑量反應(yīng)時(shí),不同的固定、標(biāo)記方法均得到較好的劑量反應(yīng)關(guān)系,其中乙醇雙標(biāo)法直線相關(guān)系數(shù)最高,各方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果所擬合曲線的斜率不同(乙醇
5、雙標(biāo)>多聚甲醛單標(biāo)>乙醇單標(biāo)),乙醇固定的細(xì)胞損失少,因此乙醇雙標(biāo)法是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞輻射劑量反應(yīng)的良好方法; 2.使用共聚焦顯微鏡檢測(cè)γH2AX劑量反應(yīng)的結(jié)果與使用流式細(xì)胞術(shù)基本一致,但在高劑量照射組(5Gy)易于出現(xiàn)“飽和”現(xiàn)象,限制了本方法在檢測(cè)高水平γH2AX上的應(yīng)用; 3.使用中性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了γH2AX的輻射劑量反應(yīng)關(guān)系的生物學(xué)機(jī)制是γH2AX特異識(shí)別DSBs; 4.TH2AX水平與電離輻射存
6、在特點(diǎn)為“快上慢下”的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系,即照射后γH2AX水平先快速增加,在1小時(shí)左右達(dá)到峰值后減少;照射劑量、衰減時(shí)間段和分析模型的選擇是γH2AX時(shí)間效應(yīng)與細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)性的重要影響因素。 本研究為建立標(biāo)準(zhǔn)化的γH2AX檢測(cè)方法提供了更為豐富的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),獲得了一個(gè)適于放射敏感性研究的γH2AX檢測(cè)方法,對(duì)照射后γH2AX時(shí)間效應(yīng)的特點(diǎn)的研究也為進(jìn)一步探討γH2AX時(shí)間效應(yīng)與細(xì)胞放射敏感性間關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。在下一步的研究中,
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