過氧化氫、Aβ（1-42）和Tau蛋白對兩原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的效應(yīng)對比研究.pdf

1、腦老化是人們在享受長壽時不可避免的事件.大量的報道指出,隨著年齡的增加,大腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少,而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和體積逐漸增加,這可能是腦老化的基礎(chǔ).衰老是引起很多疾病的誘因,阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)就是最常見的一種衰老相關(guān)的疾病.目前已經(jīng)證實,β淀粉樣蛋白沉積在細(xì)胞外形成的老年斑和過磷酸化的tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD最主要的病理學(xué)特征. β-淀粉樣蛋白在衰老的星形膠

2、質(zhì)細(xì)胞的研究很少,也無tau蛋白對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究報道.本實驗我們首先建立了兩分別來自SAM R1和P8新生小鼠大腦皮質(zhì)的原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞,模擬衰老過程中的星形膠質(zhì)細(xì)胞.繼而以這兩細(xì)胞作為實驗對象,研究了不同濃度的過氧化氫、Aβ1-42和tau蛋白對不同分化成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用,探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在衰老過程中的功能變化. 第一部分 星形膠質(zhì)細(xì)胞的建立及細(xì)胞增殖能力檢測 目的:建立兩分別來自衰老傾向小鼠S

3、AM P8和R1新生鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞,并檢測兩細(xì)胞的增殖能力. 方法: (1)采用原代培養(yǎng)方法從新生(1-3天)SAMP8和R1小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞,接種于無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶,于37℃5﹪CO<,2>孵箱培養(yǎng)并觀察細(xì)胞的生長狀況.于第7-8天在200rmp/min轉(zhuǎn)速下振搖純化細(xì)胞8h,棄去懸浮細(xì)胞并換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),直至進(jìn)行下一步實驗; (2)采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測GFAP蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表

4、達(dá),并檢測獲得的兩星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度; (3):MTT還原實驗檢測兩細(xì)胞的增殖能力. 結(jié)論:首次原代培養(yǎng)了兩來自具有不同衰老程度的小鼠(SAMR1和P8)新生鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞.SAMR1和P8新生鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時可能具有不同的增殖能力. 第二部分 過氧化氫對兩星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用 目的:研究并比較不同濃度的過氧化氫(H<,2>O<,2>)對兩星形膠質(zhì)細(xì)胞(SAM P8和R1)的作用

5、. 方法:不同濃度的過氧化氫(H<,2>O<,2>)(0,100,200,400 μ M)分別處理兩細(xì)胞1小時或4小時后,掃描電子顯微鏡(SEM)觀察過氧化氫對兩星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響;MTT實驗檢測兩細(xì)胞還原能力;碘化丙啶染色熒光鏡下檢測細(xì)胞存活;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)的染色方法原位檢測細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞乳酸脫氫酶活性; Western blot檢測過氧化氫對星形膠質(zhì)細(xì)胞膠

6、質(zhì)纖維酸蛋白(GFAP)、超氧化物歧化酶(SOD)及凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和Bax的表達(dá)水平. 結(jié)論:兩分別來自SAM P8和R1新生小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用過氧化氫處理后,兩細(xì)胞死亡率具有顯著性差異.在損傷后,兩細(xì)胞具有相同的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缥⒔q毛和側(cè)突丟失.高濃度過氧化氫(400μM)短時間處理細(xì)胞(1小時)能增加細(xì)胞的合成;而較高濃度過氧化氫(200μM)長時間處理細(xì)胞(4小時)能降低細(xì)胞內(nèi)合成,引起微管聚合.過

7、氧化氫處理后兩細(xì)胞可以有相似的效應(yīng):MTT還原能力和膠質(zhì)纖維酸蛋白表達(dá)下降,碘化丙啶檢測細(xì)胞死亡增加,TUNEL染色方法原位檢測細(xì)胞凋亡增加,超氧化物歧化酶、切冬酶-3和Bax表達(dá)上調(diào).過氧化氫400μM處理時,P8細(xì)胞和R1細(xì)胞反應(yīng)具有顯著性差異(p<0.05),表明P8和R1兩細(xì)胞在對抗氧化應(yīng)急時可能有不同的后果,并提示在高濃度過氧化氫刺激時能明顯減弱P8星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元丟失的保護(hù)作用,目前機(jī)制尚不清.老化程度不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞

8、對過氧化物解毒能力改變在中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老和衰老相關(guān)的發(fā)病過程,可能有重要的作用. 第三部分 Aβ(1-42)和Tau蛋白對兩星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用 目的:探討并比較 A β(1-42)和 tau 蛋白單獨或聯(lián)合處理對兩星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用. 方法:用不同濃度的 Aβ(1-42) (1μM和5μM)、tau蛋白(100nM)及兩者物質(zhì)的混合物Aβ(1-42)1μM/5μM+tau 蛋白(100nM)及不含Aβ和tau蛋白

9、的DMEM/F-12無血清培養(yǎng)基(對照組),分別處理兩星形膠質(zhì)細(xì)胞(SAM P8和R1)24小后,用免疫細(xì)胞化學(xué)分別檢測蛋白激酶 C (cPKC)、己糖激酶(Hexokinase)、乳酸脫氫酶(LDH)、Aβ前體蛋白(APP)、NMDA受體、GFAP在兩細(xì)胞的表達(dá),用 Western blot 分別檢測GFAP、乳酸脫氫酶(LDH)、切冬酶.3(caspase-3)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體、己糖激酶(Hexokinase

10、,HXK)、蛋白激酶 C (cPKC)、A β前體蛋白(APP)、S100β蛋白分別在兩細(xì)胞中的表達(dá).應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察 Aβ(1-42)和 tau 蛋白處理后兩細(xì)胞GFAP蛋白和微管蛋白 (Tubulin) 的共表達(dá). 結(jié)論:首次應(yīng)用Aβ(1-42)和tau蛋白對兩不同分化成度的細(xì)胞(SAMR1和P8)比較研究,發(fā)現(xiàn)Aβ(1-42)與tau蛋白對兩細(xì)胞(SAM R1和P8)的cPKC、HXK、LDH、APP、NMDA r